小麦内质网氧化还原酶的分子改造与毕赤酵母重组高效表达

论文摘要

小麦内质网氧化还原酶（wEro1）具有显著提高面粉加工品质的能力,有望成为提高面粉筋力的新型生物改良剂。但其用于工业生产应用,仍有一定的局限性。受催化效率、表达量、稳定性等限制,生产成本相对较高。本文以wEro1为研究对象,在对野生型wEro1的基本性质进行探讨的基础上,通过理性设计对其进行分子改造,最终获得了活性得到提升的正向突变体。同时,利用毕赤酵母表达系统表达了野生型wEro1,经优化后实现了wEro1的异源高效表达。主要研究内容:（1）wEro1基本性质的测定。大肠杆菌重组wEro1的比酶活为201.35±14.37 U/mg;最适反应pH为7.5,最适反应温度为35℃;在低温和中性条件下稳定性较好;Cu2+等金属离子对wEro1表现出明显的抑制作用;SDS、Tween-20和Triton X-100对wEro1的活性都表现出一定的抑制作用。（2）wEro1的分子改造。以序列同源性分析和同源建模结构为指导,通过理性设计,选择了处于活性位点或活性调控相关的9个半胱氨酸残基进行定点突变,应用重叠延伸PCR技术实现了9个半胱氨酸残基的定点突变,进一步构建了重组突变型wero1基因的原核表达载体。（3）正向突变体的筛选。在大肠杆菌表达体系中,成功可溶表达了8个突变型重组wEro1,筛选得到了5个活性得到提升的正向突变体,分别是:C105A（wEro1的第105位半胱氨酸残基突变为丙氨酸残基）、C124A、C149A、C220A和C229A,其中,活性增加最为明显的是C220A和C105A,分别增加了119.64%和101.74%的活性。（4）wEro1在毕赤酵母中的高效表达。成功构建了wEro1的真核表达载体pPICZαA-wero1,并实现了其在毕赤酵母GS115中的表达。通过单因素试验和正交试验优化了表达条件,优化后其表达量可达53.24?2.11 U/mL。等体积发酵液下,毕赤酵母表达系统表达量是大肠杆菌表达系统表达量的14.7倍,实现了wEro1的高效表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
•   1.1 内质网氧化还原酶
•     1.1.1 Ero1的简介
•     1.1.2 Ero1的催化机制
•     1.1.3 Ero1的应用前景
•   1.2 蛋白质分子改造技术
•     1.2.1 蛋白质分子改造策略
•     1.2.2 蛋白质分子改造常用手段
•     1.2.3 分子改造Ero1的研究现状
•   1.3 毕赤酵母表达系统
•     1.3.1 毕赤酵母表达系统简介
•     1.3.2 毕赤酵母表达系统高效表达策略
•   1.4 本课题的研究意义及内容
•     1.4.1 研究意义
•     1.4.2 研究内容
• 第二章 wEro1基本性质研究
•   2.1 引言
•   2.2 实验材料及设备
•     2.2.1 宿主菌株与质粒
•     2.2.2 重组蛋白质
•     2.2.3 主要仪器设备
•     2.2.4 主要试剂
•     2.2.5 主要溶液的配制
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 重组wEro1的制备
•     2.3.2 辅基FAD结合重组wEro1的检测
•     2.3.3 重组wEro1的酶学性质分析
•     2.3.4 wEro1的蛋白胶内酶解辅助高分辨液质（LC-MS/MS）分析
•   2.4 结果与讨论
•     2.4.1 重组wEro1的氨基酸序列分析
•     2.4.2 重组wEro1的SDS-PAGE分析
•     2.4.3 辅基FAD结合重组wEro1的检测
•     2.4.5 重组wEro1的酶学性质分析
•     2.4.6 wEro1的蛋白胶内酶解辅助高分辨LC-MS/MS分析
•   2.5 本章小结
• 第三章 wEro1的分子改造
•   3.1 引言
•   3.2 实验材料及设备
•     3.2.1 宿主菌株与质粒
•     3.2.2 主要仪器设备
•     3.2.3 主要试剂
•     3.2.4 主要溶液的配制
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 定点突变位点的选择
•     3.3.2 重叠延伸PCR定点突变
•     3.3.3 突变型重组wEro1表达载体的构建
•     3.3.4 突变型重组wEro1表达载体鉴定
•   3.4 结果与讨论
•     3.4.1 定点突变位点的选择
•     3.4.2 wEro1的定点突变
•     3.4.3 突变型重组wEro1表达载体的构建
•   3.5 本章小结
• 第四章 突变型重组wEro1的表达及性质研究
•   4.1 引言
•   4.2 实验材料及设备
•     4.2.1 主要仪器设备
•     4.2.2 主要试剂
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 突变型重组wEro1的异源表达
•     4.3.2 突变型重组wEro1的纯化及浓度测定
•     4.3.3 突变型重组wEro1的结构分析
•     4.3.4 突变型重组wEro1的活性分析
•     4.3.5 突变型重组wEro1的稳定性分析
•   4.4 结果与讨论
•     4.4.1 突变型重组wEro1的异源表达
•     4.4.2 突变型重组wEro1的纯化
•     4.4.3 突变型重组wEro1的结构分析
•     4.4.4 突变型重组wEro1的活性分析
•     4.4.5 突变型重组wEro1的稳定性分析
•   4.5 本章小结
• 第五章 wEro1在毕赤酵母中的表达
•   5.1 引言
•   5.2 实验材料及设备
•     5.2.1 宿主菌株与质粒
•     5.2.2 重组蛋白质
•     5.2.3 主要仪器设备
•     5.2.4 主要试剂
•     5.2.5 主要溶液的配制
•   5.3 实验方法
•     5.3.1 wero1 真核表达载体的构建
•     5.3.2 重组毕赤酵母菌株的构建
•     5.3.3 毕赤酵母重组wEro1的表达
•     5.3.4 wEro1的活性测定
•     5.3.5 wEro1的表达条件优化
•     5.3.6 wEro1的分离纯化
•     5.3.7 毕赤酵母重组wEro1的酶学特性分析
•     5.3.8 重组wEro1对面粉粉质特性的影响
•   5.4 结果与讨论
•     5.4.1 wero1 真核表达载体的构建
•     5.4.2 毕赤酵母重组表达菌株的鉴定
•     5.4.3 毕赤酵母表达产物鉴定
•     5.4.4 wEro1的表达条件优化
•     5.4.5 wEro1的分离纯化及活性测定
•     5.4.6 毕赤酵母重组wEro1的酶学特性研究
•     5.4.7 重组wEro1对面粉粉质特性的影响
•   5.5 本章小结
• 结论与展望
•   一、结论
•   二、创新点
•   三、展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 附件

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李旺

导师: 胡松青

关键词: 小麦内质网氧化还原酶,酶活性,分子改造,高效表达

来源: 华南理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 华南理工大学

基金: 国家自然科学基金项目(31471691,31771906)

分类号: Q78

DOI: 10.27151/d.cnki.ghnlu.2019.001435

总页数: 98

文件大小: 3744K

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