一、Cloning and identification of apoptosis specific DNase inhibitor IXAD in Xenopus egg extract（论文文献综述）
魏一鸣[1]（2021）在《玉米籽粒发育调控基因ZmNPF7.9和ZmAPP1的克隆与功能分析》文中提出玉米（Zea mays L.）是世界三大重要的粮食作物之一,也是饲料和工业原料的重要来源。而玉米籽粒发育又是产量和品质形成的重要基础,对玉米籽粒发育突变体的研究可以为玉米遗传改良提供理论参考。本研究中,我们从EMS诱变的B73突变体库中筛选了两个玉米籽粒发育突变体nrt1/ptr family 7.9（npf7.9）和a p-loop GTPase protein 1（app1）,并通过图位克隆鉴定到相应的基因,分别命名为Zm NPF7.9和Zm APP1。通过分子生物学、生物化学和遗传学的手段深入解析了这两个基因的功能,主要结果如下:1.Zm NPF7.9基因的克隆与功能分析npf7.9突变体籽粒变小、粒重显着下降。重要的是,突变体植株生长与野生型除了株高略微降低,其它性状无明显差异。遗传分析表明该突变表型为受单个核基因控制的隐性性状。图位克隆结果表明在npf7.9-ref突变体中基因Zm00001d019294发生了单核苷酸突变（G到A）,导致TGC（Cys/C）到TAC（Tyr/Y）密码子转变。同时我们检测了该基因在等位突变体npf7.9-1中的突变情况,发现在基因第四个外显子存在一个G→A的单碱基替换导致翻译提前终止。等位杂交测试进一步证实了Zm NPF7.9的突变是导致表型产生的原因。该基因编码一个NRT1/PTR Family（NPF）家族的硝酸盐转运蛋白,故命名为Zm NPF7.9。ZmNPF7.9基因在玉米胚乳传递细胞层中特异表达,透射电镜观察发现npf7.9突变体胚乳传递细胞发育迟缓,授粉后6天的传递细胞仍没有壁内突的结构,从而影响了玉米籽粒中贮藏物质的积累。利用异源表达爪蟾卵母细胞系统,对注射Zm NPF7.9-c RNA的卵母细胞进行功能分析发现,Zm NPF7.9是一个低亲和力、p H依赖的双向硝酸盐转运体。同时利用玉米原生质体表达Zm NPF7.9-e GFP融合蛋白,发现该蛋白定位于细胞质膜。以上结果表明,Zm NPF7.9在胚乳传递细胞层发挥功能,负责从母体组织向发育中的胚乳运输营养物质。通过检测野生型和npf7.9突变体成熟籽粒中的硝酸盐和淀粉含量发现,npf7.9突变体中硝酸盐及淀粉含量显着降低,这可能是导致npf7.9突变体粒重下降的原因。我们利用转录组学和代谢组学的方法深入解析了npf7.9突变体和野生型在基因表达和代谢水平方面的差异。结果发现在npf7.9突变体中多数与糖酵解/糖异生、碳固定、碳代谢和氨基酸生物合成途径相关的关键基因均显着下调。同时在突变体中脂类和氨基酸等代谢物也显着下调。以上结果表明,Zm NPF7.9通过调节营养物质的运输和代谢,在玉米籽粒发育和粒重中发挥了特定的作用,这可能为玉米遗传改良提供有用的基因资源。2.ZmAPP1基因的克隆与功能分析与野生型相比,app1突变体表现为籽粒变小、种皮皱缩、粒重显着下降的表型。组织学切片实验结果表明,app1突变体胚乳传递细胞层和糊粉层细胞结构分化异常,主要表现为胚乳传递细胞层结构呈不规则的立方体细胞形状,糊粉层细胞排列紊乱。app1突变体中央淀粉胚乳细胞发育迟缓,干物质积累减少。我们还发现app1突变体胚胎发育迟缓,其胚胎尽管可以分化出成熟胚的结构,但不能正常萌发。通过体外胚挽救实验,突变体的胚可以长出幼苗,但幼苗生长缓慢最终死亡。遗传分析表明,app1突变体的表型是受单个核基因控制的隐性性状。对籽粒性状进一步深入分析发现,app1突变体醇溶蛋白及淀粉含量降低、可溶性糖含量升高、碳氮比升高。这些结果表明突变体胚乳细胞发育缺陷导致营养物质积累失衡,从而产生了小籽粒的表型。图位克隆结果表明,基因Zm00001d047046的第一个外显子上发生了一个G→A的转变,该突变导致氨基酸由天冬氨酸转变为天冬酰胺。同时我们利用CRISPR技术获得了Zm APP1敲除的转基因株系并进行等位测验,进一步证实了Zm APP1蛋白的功能缺失导致了籽粒发育缺陷的表型。Zm APP1是一个组成型表达的基因,但在早期的籽粒表达较高,这说明Zm APP1在籽粒的早期发育过程中起关键作用。通过进化树及蛋白序列特征分析发现,Zm APP1含有一个保守GTP结合结构域,属于P-loop GTPase家族的一个成员。体外酶活实验进一步证实了Zm APP1具有GTP水解酶活性。同时利用玉米原生质体表达Zm APP1-e GFP融合蛋白发现APP1编码一个线粒体定位的GTPase。ZmAPP1与枯草芽孢杆菌的YIq F和人类中核糖体组装因子MTG1同源。定量检测发现app1突变体中编码线粒体核糖体蛋白的基因转录本积累,这暗示Zm APP1可能参与了线粒体核糖体的组装。同时我们发现编码电子传递链复合体组分的线粒体基因在app1突变体中转录水平提高。通过进一步检测野生型和app1突变体中线粒体蛋白的表达水平,发现突变体中线粒体蛋白水平存在不同程度地变化。这说明Zm APP1蛋白的突变影响了线粒体内的蛋白稳态平衡。另外我们发现app1突变体中线粒体超级复合体I+III2的丰度及活性均降低,突变体线粒体结构明显受损,没有明显的嵴结构,线粒体内多空腔,导致胚乳中活性氧过量积累,从而促使胚乳细胞程序化死亡提前,这表明Zm APP1通过维持线粒体的结构和功能影响籽粒发育。
张茹静[2]（2021）在《绵羊卵母细胞成熟过程中3’-UTR调控mRNA翻译非经典机制研究》文中研究说明哺乳动物卵母细胞的减数分裂成熟依赖于时间和空间调控的细胞质多聚腺苷酸化和母源信使RNA（message RNA,mRNA）的翻译激活。细胞质多聚腺苷酸化由mRNA 3’-UTR上包括多聚腺苷酸化信号（Polyadenylation signal,PAS）,和胞质多聚腺苷酸化元件（Cytoplasmic polyadenylation element,CPE）在内的顺式作用元件调控。近期研究表明,小鼠卵母细胞母源mRNA 3′-UTR远端的PAS也可以激活相应mRNA的翻译。研究者只在小鼠卵母细胞生发泡（Germinal vesicle,GV）时期及生发泡破裂（Germinal vesicle breakdown,GVBD）过程中对mRNA的翻译机制进行了探索。但是在大型哺乳动物卵母细胞中是否也存在这种非经典的翻译起始调控机制并不清楚。在本研究中,我们将利用绵羊卵母细胞,对mRNA翻译的非经典机制的普适性进行探究,进一步找到绵羊独特的mRNA翻译调控机制。本文选取了绵羊CPEB1基因的3′-UTR来探究PAS的位置和数量对目的基因翻译激活效率的影响。我们利用绵羊CPEB1基因的3′-UTR探究了CPE和PAS的相对距离对翻译起始的影响。最后我们选取了BTG4基因的3′-UTR来探究CPE元件的位置和数量对目的基因翻译抑制效率的影响。我们进行了以下五方面的研究。（1）通过构建一系列突变载体结合荧光观察和免疫印迹技术,证实了近端PAS在绵羊中同样可以激活目的基因的翻译。（2）随后发现了PAS的位置对翻译起始效率有影响,即近端PAS对目的基因的翻译激活效率更高,远端PAS对目的基因的翻译激活效率较低。（3）更进一步,我们探究了PAS的数量对目的基因翻译激活效率的影响,PAS的数量越多,其对目的基因的翻译激活效率越强。（4）在GV期绵羊卵母细胞中,CPE对目的基因的翻译抑制方面,我们发现绵羊与小鼠中存在同样的规律,即CPE在距离PAS相对较近的位置（小于50 bp）时,对目的基因的翻译有抑制作用。（5）与小鼠类似,我们发现当绵羊卵母细胞中目的基因的3′-UTR上存在多个CPE时,与位于PAS同侧的CPE对翻译的抑制效率相比,位于PAS两侧的CPE对目的基因的翻译抑制效率更强。（6）CPE的数量越多,其对目的基因的翻译抑制效率越强。综上所述,在绵羊卵母细胞中,PAS和CPE的位置和数量以及二者的距离,均可影响目的基因的翻译起始效率。该研究结果将为人们进一步理解家畜卵母细胞成熟过程中的mRNA翻译起始调控提供重要借鉴。
谭卫星[3]（2021）在《外泌体Dvl3 mRNA调节Wnt通路对关节滑膜增殖、炎症的作用及其机制》文中进行了进一步梳理一、背景类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种以对称性、侵蚀性和破坏性关节炎为特点的慢性全身性自身免疫性疾病,其中RA患者关节成纤维样滑膜细胞（Fibroblast-1ike synoviocyte,FLS）的生物学特征改变及功能异常被认为与RA的发病密切相关。人们对导致RA-FLS“肿瘤样增殖”表型的分子机制目前仍知之甚少,猜测可能是细胞暴露于体内类风湿炎症环境中以某种方式的被动应答,而这一炎症环境中的效应分子包括最新研究发现的一些新的生物标志物如:外泌体,后者被认为同样具有潜在的临床诊断和治疗作用。我们既往研究显示在Wnt经典及非经典两条信号通路中扮演着交叉点角色的Dvl的一个亚型即Dvl3分子在RA血清外泌体中显着升高。推测Dvl3这一分子在RA中可能具有诱人的研究前景,因此本研究旨在探寻Dvl3在RA中的表达模式以及通过外泌体这一方式研究Dvl3 mRNA在RA中的功能及作用机制,为将来能够更深入了解RA的发病机制及发现新的可能的治疗靶点奠下基础。二、研究目的第一部分:明确Dvl3在RA患者滑膜组织和细胞以及胶原诱导关节炎小鼠模型（CIA）滑膜组织中的表达情况。第二部分:明确外泌体Dvl3 mRNA在体外对成纤维样滑膜细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及炎性反应的作用。第三部分:明确外泌体Dvl3 mRNA在体内对CIA模型疾病程度、疼痛、滑膜破坏和凋亡、软骨和骨破坏以及血清炎性因子水平的影响。第四部分:探讨Dvl3 mRNA发挥上述作用的可能下游机制。三、研究方法第一部分:（1）分别收集了6例RA和创伤（Trauma）患者的膝关节滑膜组织,经固定、包埋、切片机组织HE染色对两组滑膜组织病理进行比较;（2）分别通过免疫组化（IHC）、蛋白印迹（WB）及实时定量PCR（q PCR）比较Dvl3在两组患者滑膜组织中的表达水平;（3）从滑膜组织中原代提取成纤维样滑膜细胞,比较Dvl3的表达水平;（4）通过构建胶原诱导关节炎（CIA）小鼠模型,比较Dvl3在疾病模型小鼠及正常小鼠膝关节中的表达水平。第二部分:（1）构建Dvl3 mRNA过表达及干扰慢病毒,鉴定摸索慢病毒感染RA-FLS条件,获得能够稳定上调或下调Dvl3 mRNA的RA-FLS;（2）进一步摸索条件通过对细胞培养上清超速离心获得能够稳定介导目标RA-FLS中Dvl3 mRNA水平改变的外泌体,并通过q PCR及WB进行验证转染效果。（3）采用Tunel及流式检测法测定不同来源外泌体转染RA-FLS后对细胞凋亡的影响;CKK8测定RA-FLS细胞活性;（4）经划痕和Transwell迁移实验比较细胞迁移能力;（5）利用Transwell侵袭实验及基质金属蛋白酶（MMPs）表达水平检测反映细胞侵袭能力;（6）提取目的细胞RNA及上清分别使用q PCR及酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各细胞因子的mRNA及蛋白水平。第三部分:（1）外泌体获取同第二部分,构建CIA小鼠模型,对小鼠关节腔注射外泌体,每周一次;（2）第二次免疫次日起对小鼠疾病评分;（3）对小鼠足爪机械痛觉进行一次评分;（4）颈椎脱臼法处死小鼠获取小鼠膝关节,分别行HE染色、番红O-固绿染色及Tunel染色对小鼠膝关节病理、软骨破坏及滑膜细胞凋亡情况进行评价;（5）门静脉取血并采用ELISA法检测各细胞因子表达水平。第四部分:（1）提取不同来源外泌体处理后的RA-FLS中的RNA,q PCR检测Wnt信号通路的关键信号分子筛选Dvl3的可能下游通路;（2）进行WB验证;（3）构建Dvl3 mRNA过表达和干扰质粒并进行转染验证,上述质粒同双荧光素酶报告基因质粒进行共转染实验,验证Dvl3对TCf以及ROCK2启动子的活性。四、结果第一部分:（1）成功提取了RA和创伤患者关节滑膜的原代FLS进行培养、鉴定及传代。（2）RA组滑膜在滑膜增生、炎性细胞浸润及毛细血管增生等方面的评分明显更高。（3）Dvl3在RA患者滑膜中的表达水平明显升高。（4）Dvl3在RA-FLS中的表达同样明显高于对照创伤组。（5）Dvl3在炎性关节炎中的表达被显着上调。第二部分:（1）CKK8结果显示来自过表达外泌体组的外泌体能够显着促进细胞增殖活性,而干扰外泌体组外泌体可以起到抑制FLS增殖的作用。（2）凋亡结果显示过表达外泌体组较对照组显着下调了RA-FLS的凋亡水平。（3）迁移及侵袭实验提示了过表达Dvl3外泌体对细胞迁移及侵袭的促进作用,同时伴有上调基质金属蛋白酶表达水平的作用,在干扰外泌体组中则观察到几乎相反的作用。（4）q PCR及ELISA法检测细胞因子含量水平提示Dvl3 mRNA过表达外泌体能够显着促进TNF-α、IL-1β、IL-17、IL-21的表达,干扰外泌体组则可以观察到IL-17和IL-21的显着下调。第三部分:（1）成功构建了CIA小鼠模型,小鼠疾病评分结果显示过表达外泌体注射组小鼠关节炎指数较对照组升高更快。（2）机械痛阈值测定结果显示干扰外泌体组小鼠疼痛阈值下降程度较对照组明显减缓。（3）WB及q PCR验证了外泌体注射干预效果。（4）HE染色提示过表达外泌体组病理评分明显高于对照组;而Sh-Dvl3 mRNA干扰外泌体注射组则有效缓解了小鼠的关节炎症。（5）番红O-固绿染色结果显示过表达外泌体组评分明显高于对照组,而干扰实验组则倾向表现出对关节软骨的保护性作用。（6）Tunel实验提示Sh-Dvl3 mRNA外泌体注射组表现出强烈的促凋亡结果。（7）ELISA结果显示Dvl3在膝关节的表达水平升高可以显着上调血清中TNF-α、IL-17及IL-21的水平。第四部分:（1）q PCR结果显示Dvl3 mRNA的过表达同样伴随着β-catenin及Rho A下游分子ROCK2的明显升高,而在Dvl3 mRNA干扰外泌体组则观察到β-catenin及Ro CK2较对照组的显着下降。以上结果经WB得到进一步验证。（2）双荧光素酶报告基因检测系统来明确Dvl3在Wnt通路两条通路中的作用,结果提示了Dvl3可以同时激活经典及非经典Wnt信号通路。五、结论本课题通过临床及动物组织样本表达、原代细胞培养体外实验研究、构建动物模型体内实验研究以及具体分子机制四个部分对Dvl3的表达以及外泌体Dvl3mRNA的功能进行了较为详尽的研究,发现了Dvl3在RA患者及炎性关节炎动物模型中的高表达,以及其在细胞水平可能具有促进细胞增殖抑制凋亡,促进迁移、侵袭及促炎性细胞因子的分泌等作用进而参与介导了关节炎的进展和加重,进一步的机制研究显示其发挥上述作用的下游途径可能离不开对Wnt经典及非经典通路的激活,包括β-catenin/TCF/LEF-1及Rho A/ROCK2通路的活化,同时Dvl3 mRNA干扰外泌体组获得的对炎症性关节炎的保护性结果为未来RA的干预治疗提供了理论基础和新的潜在靶点。
江俊超[4]（2021）在《小鼠卵母细胞减数分裂过程中母源mRNA的翻译调控机制研究》文中研究指明在哺乳动物卵子发生过程中,活跃的转录和翻译活动为卵母细胞积累了大量的母源m RNA和蛋白,这些母源m RNA的胞质聚腺苷酸化和翻译激活驱动着减数分裂过程的进行。胞质聚腺苷酸化过程由多个蛋白共同调节,主要包括poly（A）聚合酶（PAP:Poly（A）polymerase）,剪切和聚腺苷酸化特异性因子（CPSF:Cleavage and polyadenylation specificity factor）。在小鼠卵母细胞发育过程中,不同的母源m RNA并不是同时被聚腺苷酸化并翻译成蛋白,胞质聚腺苷酸化的时空特异性受到m RNA的3?-UTR上顺式元件的调控,主要包括聚腺苷酸化信号（PAS:Polyadenylation signal）和细胞质聚腺苷酸化元件（CPE:Cytoplasmic polyadenylation element）,二者分别与CPSF复合体以及CPE结合蛋白（CPEB:Cytoplasmic polyadenylation element binding protein）结合。一直以来,人们对于卵母细胞减数分裂过程中m RNA胞质聚腺苷酸化的时空特异性调控规律以及负责调节该过程的poly（A）聚合酶均不是很清楚。在本课题的研究中,我通过使用小鼠Cpeb1,Btg4和Cnot6l m RNA的3?-UTR,破译了在减数分裂成熟过程中调控特定发育时期m RNA翻译的组合密码:（i）母源转录本在生发泡（GV:Germinal vesical）时期的翻译需要一个以上远离CPEs的PASs;（ii）距离转录本3?末端的远端和近端的PAS,只要周围没有CPEs,他们均能够有效调节GV时期的翻译;（iii）在GV期的翻译抑制和生发泡破裂（GVBD:Germinal vesical breakdown）之后的翻译激活需要至少一个临近CPEs的PASs;（iv）一个特定转录本的3?-UTR上靠近PASs的CPEs的数量和位置,决定了它在GV期卵母细胞的抑制效率。这些研究揭示了一个之前未发现的机制,即近端PAS如何调控母源转录本3?末端的聚腺苷酸化和翻译。另外我也确定了PAPα是长期寻找的在小鼠卵母细胞成熟过程中调节m RNA胞质聚腺苷酸化的poly（A）聚合酶。我的研究发现PAPα在GV期主要定位在核内,但在GVBD后分散到胞质中。抑制PAPα活性会损害胞质m RNA的聚腺苷酸化和翻译,从而阻止减数分裂细胞周期的进行。卵母细胞恢复减数分裂后,激活的CDK1和ERK1/2共同调节PAPα的三个丝氨酸残基（S537、S545和S558）的磷酸化,从而导致PAPα活性增加。该机制能够使3?-UTR上不含CPE的转录本也发生翻译激活。在GVBD之后,激活的PAPα也可以通过正反馈通路刺激其自身m RNA的聚腺苷酸化和翻译。除此之外,ERK1/2也能以3?-UTR上CPE依赖的方式促进Papola m RNA的翻译。通过这些机制,PAPα活性和蛋白水平显着增强,从而提升了整体m RNA聚腺苷酸化和翻译的水平,有利于减数分裂细胞周期的正常进行。
徐妲[5]（2020）在《SUMO化与猪卵母细胞体外成熟、胚胎发育及孤雌胚胎发育相关研究》文中研究说明哺乳动物中,SUMO（small ubiquitin-like modifier,小类泛素相关修饰物）作为重要的翻译后修饰存在于许多细胞过程中,它包括4种SUMO分子,SUMO-1、SUMO-2、SUMO-3和SUMO-4。其中SUMO-1参与细胞内蛋白质分解、细胞周期、细胞增殖、基因表达、细胞凋亡、DNA复制和修复、核质转运、信号转导和转录等生物学过程。SUMO化受E1、E2和E3酶的催化与底物蛋白结合而起作用。活性氧作为细胞外和细胞内不能缺少的信号分子,在细胞中会进行一系列的基因表达调控或者蛋白质转录翻译后修饰调控,它可以在结合或去结合水平上调节SUMO。然而在猪卵母细胞体外成熟和胚胎体外发育过程中,SUMO化的分子机制还不清楚。因此,本研究的主要目的是探究SUMO化的E1激活酶UBA2、E2结合酶UBC9以及过氧化氢对猪卵母细胞体外成熟与凋亡、精-卵结合、孤雌激活和体外受精后胚胎发育的影响。本试验分为三部分,结果如下:试验一:类泛素化E1激活酶UBA2对猪卵母细胞体外成熟、凋亡及孤雌激活的影响1.不同直径卵泡中提取的卵母细胞蛋白进行类泛素化SUMO-1蛋白含量测定,直径小于3mm和3-6mm的卵母细胞蛋白中的SUMO-1蛋白含量显着地高于直径大于6mm的处理组。2.在卵母细胞体外成熟液中添加UBA2,提取成熟卵母细胞蛋白。在分子量约为67、96和123 ku处出现SUMO-1蛋白条带,10 μg/mL UBA2处理组SUMO-1蛋白含量显着升高。3.猪卵母细胞体外成熟培养液中添加UBA2后,10μg/mL UBA2处理组的卵母细胞成熟率显着升高。4.挑选优质卵丘细胞进行Annexin v-FITC/PI双染色,利用流式细胞仪检测卵丘细胞的凋亡情况,细胞的凋亡率分别为:3.50%、3.31%、0.66%和0.42%,经10 μg/mLUBA2处理后,极显着降低了细胞的凋亡。5.挑出优质成熟卵母细胞并提取RNA,利用RT-qPCR法分别检测凋亡相关基因,基因水平分为两种趋势,在5μg/mLUBA2处理组中,Bcl-2基因表达显着上调,而Bax基因显着下调,添加10μg/mLUBA2处理组中Caspase3基因显着下调。6.添加UBA2的卵母细胞成熟并孤雌激活后,5 μg/mL UBA2处理组的卵裂率显着升高,而10 μg/mL UBA2处理组囊胚率显着升高。试验二:类泛素化E2结合酶UBC9对猪卵母细胞体外成熟、凋亡及胚胎发育的影响1.在卵母细胞体外成熟液中添加UBC9,提取成熟卵母细胞蛋白。在分子量约为59和71ku处出现SUMO-1蛋白条带,10 μg/mL UBC9处理组SUMO-1蛋白含量显着降低。2.卵母细胞成熟培养液中添加UBC9培养成熟后,5μg/mL UBA2处理组的卵母细胞成熟率显着降低。3.挑选优质卵丘细胞进行Annexin v-FITC/PI双染色,利用流式细胞仪检测卵丘细胞的凋亡情况,细胞的凋亡率分别为:4.71%、15.96%、21.63%和25.79%,5μg/mL UBC9处理组显着促进细胞的凋亡,10和15 μg/mL UBC9处理组极显着促进细胞的凋亡。4.利用RT-qPCR法分别检测凋亡相关基因,在10μg/mLUBC9处理组中,Bcl-2基因表达显着下调。在添加5 μg/mL时Bax和Caspase3基因显着上调。5.卵母细胞体外成熟受精后,10 μg/mL UBC9处理组显着降低了胚胎的卵裂率。试验三:过氧化氢对猪卵母细胞类泛素化修饰及精-卵结合的影响1.在体外成熟培养液中添加不同浓度的H2O2,75 μg/mL H2O2处理组中,卵母细胞成熟率显着降低。可见,添加高浓度的H2O2降低了卵母细胞成熟率,而低浓度的H2O2对卵母细胞成熟率没有显着影响。2.在卵母细胞成熟培养液中添加不同浓度的H2O2,免疫印迹分析后,在18和77 ku处出现SUMO化标记,75μg/mL H2O2处理组的SUMO-1蛋白表达量显着降低,这些结果表明,H2O2对猪卵母细胞体外成熟中SUMO-1蛋白起抑制作用。3.添加不同浓度的H2O2培养44 h后,利用流式细胞仪检测卵丘细胞的凋亡情况。细胞的凋亡率分别为:6.26%,8.22%,22.85%,40.13%,43.45%,凋亡率逐渐增加,并且经75 μg/mL H2O2处理后,显着促进细胞的凋亡。4.添加不同浓度为H2O2后,挑出优质成熟卵母细胞并提取RNA,利用qRT-PCR法分别检测凋亡相关基因。结果在75 μg/mL H2O2处理组中,Bcl-2基因表达显着下调而Caspase3基因表达显着上调。Bax基因在50μg/mL H2O2处理组中显着上调。5.卵母细胞体外成熟培养液中添加H2O2后,75μg/mL H2O2处理组显着减少ZP溶解度。6.精-卵结合后,添加75μg/mL H2O2处理时蓝色荧光开始变少,显着减少了卵母细胞附着精子的数量。综上所述,UBC9、H2O2降低了猪卵母细胞体外成熟率、SUMO-1蛋白含量,增加了卵丘细胞凋亡以及凋亡基因的表达。并且,UBC9降低了体外受精后胚胎的发育,而H2O2延长了ZP溶解度,减少了卵母细胞附着精子的数量。UBA2提高了卵母细胞体外成熟率、SUMO-1蛋白含量以及孤雌激活后胚胎的发育,降低了凋亡基因的表达减少了卵丘细胞凋亡。本研究结果将为卵母细胞类泛素化修饰提供更多的理论基础,对日后的生殖生产提供更多的理论依据。
任帆[6]（2020）在《igf2bp3在斑马鱼胚胎发育中的功能研究》文中指出在动物早期胚胎发育过程中,母源遗传的m RNA对早期胚胎的发育起到重要作用。虽然在脊椎动物中,母源m RNA降解的机制已被广泛研究,但胚胎如何维持母源m RNA的稳定性仍不清楚。在本研究中,我们确定了igf2bp3是斑马鱼母源m RNA稳定性的重要调节因子。在母源合子转换（maternal-to-zygotic transition,MZT）之前,母源igf2bp3缺失会破坏母源的m RNA稳定性,导致严重的发育缺陷,包括异常的细胞骨架重组和细胞分裂。然而,在igf2bp3突变体中,未受精卵的母源m RNA表达水平却是正常的。另外,Igf2bp3能结合母源m RNA,通过GO富集分析发现这些基因大部分富集在RNA调控与代谢、细胞分裂、细胞骨架组装和表观修饰过程中。事实上,igf2bp3的缺失会破坏母源m RNA稳定性,导致母源m RNA在pre-MZT阶段发生大规模降解。相反,过表达igf2bp3 m RNA则会增强Igf2bp3结合的母源m RNA稳定性,并伴有胚胎发育迟缓现象。总之,这些发现说明Igf2bp3通过结合母源m RNA并维持母源m RNA的稳定性,控制斑马鱼早期胚胎发育过程。在斑马鱼早期胚胎发育过程中,生殖质由卵母细胞累积并遗传给后代。生殖质组装受到Buc介导的生殖质m RNA（GP-m RNA）表达调控,但其中的具体机制仍不清楚。在本研究中,我们证明了m6A读取蛋白Igf2bp3与Buc相互作用,并共同定位在生殖质中。与Buc表型类似,母源igf2bp3突变体出现生殖质组装异常以及生殖细胞发生缺陷,如生殖质m RNA在分裂沟中降解,以及胚胎中PGCs数量减少等。通过注射igf2bp3 m RNA可以部分挽救生殖质组装缺陷。但是,母源igf2bp3缺失的突变体,其卵母细胞形态和结构与野生型进行比较,并未发现差异。同时,发现igf2bp3突变之后,生殖质m RNA定位也是正常的,这些数据说明缺失母源igf2bp3对生殖质m RNA的定位及卵母细胞的发生并未造成影响。Igf2bp3可以与m6A修饰的生殖质组织者Buc相互作用,也能结合生殖质m RNA以防止这些m RNA降解。这些研究结果表明,Igf2bp3是Buc功能的直接效应蛋白,并依赖m6A修饰的调控方式,参与生殖质m RNA的表达和生殖质组装,并证实m6A修饰在生殖质组装过程中的重要作用。综上所述,在斑马鱼胚胎发育中,igf2bp3是维持母源RNA稳定性和生殖质组装所必需的。
郑稳稳[7]（2020）在《细胞中化学修饰蛋白及生物大分子相互作用的核磁共振研究》文中提出细胞是生命的基本单位,也是生物大分子发挥生物功能的主要场所。细胞的环境极其复杂,它内部的体积排阻和化学弱相互作用时刻影响着生物大分子的状态变化和功能发挥。细胞内核磁共振（In-cellNMR）可以在活细胞内获得原子水平分辨的生物大分子结构动态信息,帮助人们了解细胞环境对于生物大分子结构和功能的影响。本文主要运用In-cell NMR方法,使用19F作为生物大分子的原子探针,对细胞内的蛋白质化学修饰、蛋白质相互作用以及核酸G-四链体稳定性及相互作用展开研究,具体内容如下:In-cell NMR方法研究细胞内α-突触核蛋白的磷酸化修饰及其降解蛋白质在细胞内会发生广泛的化学修饰,磷酸化是其中一种十分常见且重要的修饰类型。现阶段,在活细胞内对蛋白质磷酸化进行直接、实时的观测仍然存在困难。本文通过In-cell NMR方法实现了细胞内蛋白质磷酸化的实时监测,并开展磷酸化修饰对蛋白质稳定性影响的研究。通过选用帕金森症相关的129位磷酸化α-突触核蛋白作为研究模型,对其在细胞内的去磷酸化过程进行跟踪研究,发现该蛋白质在细胞内会快速去磷酸化,并且129位磷酸化修饰会加快α-突触核蛋白质降解。本文的研究表明,In-cell NMR可以很好的应用于活细胞内蛋白质磷酸化修饰的研究,能实时跟踪磷酸化修饰对蛋白质命运的影响,为细胞内蛋白质修饰研究提供互补的新思路及新方法。In-cell NMR方法研究细胞环境对蛋白质相互作用的调控蛋白质相互作用是多个蛋白质协同合作,发挥功能并完成生理过程的重要前提。已有研究表明,模拟细胞环境如拥挤试剂、高浓度蛋白质及细胞裂解液都会对蛋白质相互作用产生影响。但真实细胞内复杂的拥挤环境会对蛋白质相互作用产生怎样的影响,目前仍然未知。本文使用19F in-cell NMR实现了在活细胞内对蛋白质二聚相互作用的定量表征。通过比较A34F GB1（GB1突变体形成的一种简单二聚体）在稀溶液和细胞内的变化,结果发现该蛋白在细胞环境中二聚能力大大增强,解离常数减少了六倍以上。在稀溶液中,A34FGB1的二聚体相互作用强弱会受到其蛋白质表面电荷的影响,而这种电荷造成的影响在细胞内会被削弱。进一步对带有不同电荷的蛋白质二聚体在不同环境中的吉布斯自由能变化的研究表明,细胞内环境与蛋白质二聚体之间的负电荷斥力,在稳定A34FGB1蛋白质相互作用上起着重要作用。本研究的结果显示,细胞内复杂的非特异性相互作用会对蛋白质的特异性相互作用产生重要影响。In-cell NMR方法研究细胞内G-四链体的稳定性及其与药物分子的相互作用G-四链体是一种非典型核酸结构,它被认为在端粒稳定性、基因的复制、重组、表达与调控等生理过程中起着重要的调节作用,而且与癌症等疾病的发生发展密切相关。体外研究表明,离子条件、大分子拥挤、相互作用等环境效应都会影响G-四链体结构,因而在更接近生理环境的细胞内原位研究G-四链体显得十分必要。本文首先对修饰人端粒片段MHT24、凝血酶结合适配体TBA和人血管内皮生长因子启动子hVEGFP三种G-四链体在生物体系中的稳定性进行探讨研究,分析了不同细胞类型、离子条件及相互作用等对G-四链体降解稳定性的影响。另外,我们借助19FIn-cell NMR方法,开展了非洲爪蟾卵母细胞内TMPyP4和360A两种药物配体小分子与MHT24的相互作用研究,结果表明复杂的细胞环境会改变甚至破坏G-四链体与药物配体小分子的相互作用,说明在细胞内原位研究核酸及其与药物相互作用的重要性。
武小雯[8]（2020）在《利用gsdf敲除青鳉研究Igf2bp3和42Sp50因子在卵细胞发育中的潜在作用》文中研究表明生殖细胞对决定分化成精子或卵细胞有复杂的调控方式,青鳉（Oryzias latipes）的生殖细胞,在自身foxl3因子和体细胞的dmy性别决定因子调控下,进入雌雄性分化。其中,性腺体细胞衍生因子（gonadal soma derived factor,gsdf）是dmy的直接下游因子,其敲除可导致XY雌性化,转基因过表达可导致XX精巢发生,但gsdf的生物学作用和靶基因仍不清楚。我们用Label Free蛋白组学结合MS质谱分析,定量比对正常的XX卵巢、XY精巢、及gsdf缺失XY卵巢中的蛋白质表达谱,发现胰岛素样生长因子2结合蛋白3（insulin-like growth 2 binding protein 3,igf2bp3）和真核翻译延伸因子1（elongation factor 1,e EF1）的卵巢异构型42Sp50的表达量在gsdf缺失卵巢中显着升高。本论文通过实时定量PCR扩增,定量分析了igf2bp3和42Sp50在XX和XY型gsdf-/-卵巢中的表达,并且对比了正常雌性和雄性的性腺,结果显示gsdf缺陷卵巢中的igf2bp3和42Sp50基因转录和翻译比正常卵巢中的更大,与蛋白组学分析结果一致。为了探究igf2bp3和42Sp50在gsdf调控下在细胞中发生的变化,我们使用抗人H3K27me3/IGF2BP3抗体和抗人H3K27me3/EEF1A抗体进行了细胞内定位。结果发现igf2bp3表达与卵母细胞发育相关,在一个月大的gsdf缺陷卵巢中,簇状生殖细胞包囊与正常卵巢相比显着增加,单囊中有h3k27me3（组蛋白3赖氨酸27 3甲基化位点）和igf2bp3阳性的生殖细胞簇,也有两者阴性的生殖细胞簇,说明igf2bp3能够介导卵细胞的发育过程。正常雄性精巢中,igf2bp3阳性生殖细胞较少,表明gsdf的缺失,消除了gsdf对X-生殖细胞的抑制作用,从而使生殖细胞进入igf2bp3介导的卵母细胞发育。gsdf耗竭导致一个月大的XY卵巢中生长的囊性生殖细胞异常增加,在一些合子和粗线期卵母细胞中表达高igf2bp3,但在生殖细胞和其他粗线期卵母细胞中igf2bp3沉默,因此,在gsdf-/-卵巢中减数分裂开始后至少出现两个卵母细胞群。我们的研究结果为gsdf-igf2bp3信号调控通路提供了新的见解,这些信号机制是配子发生的基本过程的基础。igf2bp3作为一种重要的RNA结合因子,能够诱导细胞增殖,参与调控细胞发育中信号通路。抗苗勒氏管激素（Anti Miillerian Hormone,amh）是TGF-β超家族的成员之一,Amh处理孕鼠,在成年期出现类似多囊卵巢综合征（Polycystic ovary syndrome,PCOS）表型[1]。青鳉,斑马鱼和罗非鱼敲除Amh同源蛋白Gsdf,都能产生初级卵母细胞增殖,类似于PCOS表型,以gsdf-/-XY青鳉为模型研究发现igf2bp3能够调控卵细胞发育过程,介导卵原细胞向初级卵母细胞的发育和分化,在人精原细胞癌,多囊卵巢综合症的病理组织切片中,生殖细胞高表达igf2bp3,推测Gsdf可能结合Amhr2调控Igf2bp3,介导卵原细胞向初级卵母细胞的发育和分化,期望为精原细胞癌、多囊卵巢综合症提供新的诊断分子标志物。在用抗人EEF1A1抗体的免疫荧光实验中鉴定了青鳉e EF1a和/或42Sp50在生殖细胞性分化及性成熟期,gsdf缺失卵巢同正常卵巢对照组的细胞内表达变化,验证了蛋白组学发现的在gsdf-/-卵巢中有大量卵细胞高表达42Sp50。青鳉e EF1a和42Sp50氨基酸序列高度同源,但在氨基酰基结合囊和核糖体结合部位有显着差异,为此我们推测Gsdf信号可能直接或间接地影响XY生殖细胞表达42Sp50和雌性分化。本试验将目光聚焦于gsdf调控下的关键因子igf2bp3和42Sp50对性别分化,尤其是雌性分化过程中可能发挥的重要调控作用进行探究,当gsdf缺失,关闭雄性分化信号通路后,Igf2bp3能够调控生殖细胞向卵细胞继续发育,42Sp50受到gsdf信号调控,表达量升高,参与维持雌性生殖细胞的发育
康秀华[9]（2020）在《HMG2L1在非小细胞肺癌的表达及作用研究》文中研究指明研究背景:在我国,恶性肿瘤已经成为一个严重的公共卫生问题。其中肺癌（Lung cancer）是我国发病率、死亡率最高的恶性肿瘤,且近年来仍呈上升趋势。根据我国肿瘤年度报告,2000年至2014年间,肺癌总体发病率呈上升趋势,2014年肺癌估计新发病例78.1万,发病率为57.13/10万;同时,估计死亡病例数为62.64万,死亡率为45.8/10万,居同期恶性肿瘤死亡原因第一位。非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌中最常见的病理类型,早期缺乏特异性症状,导致约2/3的患者在诊断时即已是晚期阶段,失去了手术机会,尽管目前的治疗手段包括化疗、放疗、靶向、免疫治疗等取得了极大的进展,然而由于肿瘤细胞的异质性和基因组不稳定性,这些治疗也仅能让少部分患者受益,且依然容易产生耐药、复发,5年生存率仍未取得重大突破。目前,对于肺癌的发病机制仍然不十分清楚。肺癌突变论坛（lung cancer mutation consortium,LCMC）研究发现约2/3的进展期肺癌病例中至少检测出一种驱动突变基因的存在3,开发针对这些靶点基因的药物可以改善部分肺癌患者的预后,目前已有的靶向药物针对靶基因突变的优势人群就显示了良好的疗效。因此,如能寻找到新的驱动基因,就有可能为解决部分肺癌患者的治疗窘境。高迁移率族（High mobility group,HMG）蛋白是一类含量丰富、进化高度保守的非组蛋白染色体蛋白,因其在电泳时有很高的迁移率而得名,该蛋白家族成员广泛存在,数量丰富,可结合到DNA或核小体上来诱导染色质结构的变化,对于染色体动力学和染色体中DNA转录、翻译等进程具有十分重要的意义。HMGs分为经典的HMG蛋白和非经典的HMG蛋白。经典的HMG蛋白发现较早,可分为HMGA（High mobility group A protein）,HMGB（High mobility group box protein）和HMGN（high mobility group nucleosome）三个亚族,分别通过“AT-hooks”、HMG盒结构域、核小体结合结构域结合到DNA或核小体上,参与染色体DNA的复制、转录、翻译、表观遗传学修饰等。非经典的HMG家族成员包括HMGXB3（HMG-box containing 3）,HMG2L1（high mobility group 2 like 1）,HMG20A,HMG20B四位成员,均发现较晚,目前研究的也较少。经典的HMG蛋白都发现与肺癌有一定的相关性,尤其是研究最深入的HMGB1参与了肺癌的发生、转移甚至化疗药物耐药,那同样含有HMG盒结构域的HMG2L1是否在肺癌的发生发展中发挥作用呢?基于此设想,本研究首先探索性的采用免疫组织化学法检测了肺癌外科切除手术标本中癌组织和癌旁组织中HMG2L1的表达水平,发现癌组织中HMG2L1的表达水平较癌旁组织明显升高,随后我们进一步扩大样本量进行检测,并分析HMG2L1的表达水平与肺癌患者临床特征的关系;同时,我们在细胞水平探索HMG2L1的肺癌发生发展中的功能及可能的作用机制,采用shRNA干扰HMG2L1的表达,并研究其对肺癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响,并初步探索了可能的机制。研究目的:1.了解HMG2L1在非小细胞肺癌的表达及与临床特征和预后的关系;2.探索HMG2L1在非小细胞肺癌的作用及可能的机制。实验方法:1.肺癌组织检测HMG2L1表达:收集外科手术切除的肺癌组织石蜡标本,采用免疫组织化学法检测HMG2L1的表达,采取H-score评分方法进行半定量评分。同时收集入组病例的基线临床资料,包括:性别,年龄,吸烟状况,合并疾病,肿瘤大小,淋巴结转移,远处转移,临床分期,病理组织分化程度等,并按期进行随访。分析HMG2L1的表达水平与患者临床资料的相关性（统计学方法采用卡方检验）以及生存预后的关系。2.细胞实验:（1）细胞培养:从ATCC细胞库购买人类NSCLC细胞系A549及H1299细胞,采用含10%血清,青霉素、链霉素的RPMI1640培养基,在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱培养,待细胞生长至90%融合时进行胰蛋白酶消化传代,按2×105/ml的接种密度接种到新培养瓶中分瓶培养,每2-3天传代1次。（2）构建HMG2L1-shRNA慢病毒载体:根据人HMG2L1基因序列,通过网站设计3对干扰序列,交由公司合成并构建质粒载体,测序分析验证,包装成慢病毒,并转染至A549细胞中,qRT-PCR法检测转染效率,选取最佳干扰序列病毒进行扩增,获得HMG2L1-shRNA慢病毒载体。（3）转染HMG2L1-shRNA慢病毒:将HMG2L1-shRNA慢病毒转染至A549细胞和H1299细胞,转染72小时后提取细胞的蛋白及RNA,采用Western blot法和qRT-PCR法鉴定转染效率。（4）建立稳定细胞表达细胞株:将转染了HMG2L1的A549细胞和H1299细胞加入预先摸索好浓度的含杀稻瘟菌素的培养基中进行筛选,反复换液传代,筛选后的细胞株采用Western blot法和qRT-PCR法鉴定HMG2L1的表达;（5）细胞功能检测:1)增殖实验:将转染对照/HMG2L1-shRNA慢病毒的A549细胞和H1299细胞接种于24孔板上,种板后第2,4,6天采用结晶紫染色法进行染色后在酶联免疫仪上检测595nm波长测定各组细胞的吸光值,根据吸光值绘制生长曲线,计算细胞增殖率;2)划痕实验:将转染对照/HMG2L1-shRNA慢病毒的A549细胞和H1299细胞接种于6孔板上,待细胞生长至90%融合时进行划痕,每12小时观察细胞迁移情况,拍照记录,并采用ImageJ软件计算划痕面积;3)侵袭实验:采用Transwell小室法,将Matrigel胶均匀铺于小室内层底部,将转染对照/HMG2L1-shRNA慢病毒的A549细胞和H1299细胞悬液接种至小室里面,用含1%FBS培养基饥饿24小室后,将小室外面替换成10%FBS完全培养基,在37℃培养箱中孵育24小时后取出小室,对小室底部外侧的细胞进行固定、染色,拍照计算细胞的数量;（6）细胞信号通路研究:将转染对照/HMG2L1-shRNA慢病毒的A549细胞和H1299细胞接种至6孔板,待细胞生长至80%融合时收集细胞提取总蛋白,采用Western blot法检测细胞信号通路相关蛋白的表达。3.统计分析:采用prism 6.0软件进行数据统计分析,数值变量用均数±标准差表示,两组间比较应用独立样本t检验,多组间的比较采用单因素方差分析（one-way analysis of variance,ANOVA）。分类变量用百分率表示,组间比较采用卡方检验（chi-square检验）。P<0.05表示具有统计学差异。实验结果:1.HMG2L1在非小细胞肺癌的表达及临床意义:（1）非小细胞肺癌患者肺癌组织及癌旁组织HMG2L1表达情况:共收集并检测了60对癌组织及癌旁组织标本,二者的HMG2L1检测水平分别为:癌组织的H-SCORE评分176±4.71,癌旁组织的H-SCORE评分为84.68±4.713,差异具有统计学意义（P<0.0001）（2）肺癌组织HMG2L1的表达水平与临床病理特征的关系:以癌组织样本中H-score评分的中位数（179.8）为界值,将肺癌组织HMG2L1表达分为低表达组（≦179.8）和高表达（>179.8）组,结果显示HMG2L1的表达水平与患者的性别、年龄、吸烟状况、肿瘤大小、病理类型、有无淋巴结转移无明显相关性,而与病理组织的分化程度、临床分期相关,HMG2L1的表达水平越高,则病理组织的分化程度越低,临床分期越晚;采用t检验进一步分析各临床特征分组中HMG2L1的表达水平,发现HMG2L1的表达水平可能与性别、吸烟与否、病理类型有一定的相关性。（3）截至2020年3月30日,60例患者中,平均随访时间为16.2月（7-21月）。60例患者中,38例患者术后未接受放化疗等肿瘤相关治疗（38/60,63%）,22例（22/60,37%）患者接受了1-8次不等周期的的化疗。出现疾病进展12例（12/60,20%）,其中死亡4例（4/60,6.7%）。12例疾病进展患者的的H-score评分为190±5.359,IA期2例（2/60,3.3%）,IB期2例（2/60,3.3%）,IIA期3例（3/60,5%）,IIIA期3例（3/60,5%）,IIIB期2例（2/60,3.3%）;4例未进行术后化疗（4/60,6.7%）,8例进行了术后化疗（8/60,13.3%）。4例死亡患者的平均H-score评分200.6±5.086,IIA期1例（1/60,1.7%）,IIIA期2例（2/60,3.3%）,,IIIB期1例（1/60,1.7%）,IIA期患者未接受化疗,其他3例均接受了化疗。截至目前随访时间,HMG2L1的高表达可能与生存预后不良相关（P<0.05）,暂时未发现两组无病生存期（DFS）的差异（P>0.05）。2.HMG2L1在非小细胞肺癌的功能及机制:（1）所筛选的3个引物序列中HMG2L1-shRNA-VL1222可以显着敲低HMG2L1,将该慢病毒转染A549细胞及H1299细胞,再通过BSD筛选成功获得了HMG2L1干扰的细胞系,经qRT-PCR和Western Blot验证转染后HMG2L1的基因和蛋白表达显着下调;（2）HMG2L1对非小细胞肺癌细胞增殖的影响:在A549细胞中敲低HMG2L1后细胞增殖率下降,且在接种的第6天具有显着差异（P<0.001）;在H1299细胞中敲低HMG2L1后同样出现细胞增殖率下降,且在接种的第6天具有显着差异（P<0.001）。对比两株细胞HMG2L1后的增殖率,A549细胞下降的似乎要明显些。（3）HMG2L1对非小细胞肺癌细胞迁移的影响:细胞划痕实验结果结果显示,A549细胞迁移较慢,需要近68-90h划痕才充分闭合;H1299迁移速度较快,36小时细胞即可迁移到对侧。转染HMG2L1-shRNA的A549细胞和H1299细胞迁移速度均较对照组慢,差异具有统计学意义（P<0.01）。（4）HMG2L1对非小细胞肺癌细胞侵袭的影响:Transwell小室实验结果显示在A549细胞敲低HMG2L1可使细胞的侵袭能力显着下降（P<0.01）,而在H1299中,转染HMG2L1-shRNA的H1299细胞穿过基质胶的能力显着下降（P<0.01）。（5）HMG2L1在非小细胞肺癌细胞中的作用机制探索:在A549细胞和H1299细胞中敲低HMG2L1后,虽然β-catenin和Wnt5a略有上升趋势,但并没有统计学意义（P>0.05）,STAT3表达也未见明显变化,这可能提示了人HMG2L1在非小细胞肺癌细胞的功能并不是通过Wnt信号通路和STAT3而发挥作用,因此,HMG2L1在非小细胞肺癌的作用机制有待进一步探索。结论:1.在非小细胞肺癌患者中,HMG2L1的表达在肺癌组织中明显高于癌旁组织;2.HMG2L1的表达水平与非小细胞肺癌病理组织的分化程度、临床分期相关,HMG2L1的表达水平越高,则病理组织的分化程度越低,临床分期越晚;同时,也可能与性别、吸烟与否、病理类型有一定的相关性,男性、吸烟、鳞癌的表达水平较高。3.HMG2L1的表达水平可能与非小细胞肺癌患者的生存预后相关,HMG2L1的表达越高,总生存期越短。目前尚未发现HMG2L1的表达水平与无病生存期的相关性。4.HMG2L1可以促进非小细胞肺癌的增殖、迁移、侵袭,可能参与了肺癌的发生和转移。5.HMG2L1在非小细胞肺癌的作用机制可能与Wnt信号通路分子β-catenin、Wnt5a及STAT3无关,可能通过其他的信号通路发挥作用。
陈华丽[10]（2020）在《Wnt/PLC/Ca2+通路对猪卵泡颗粒细胞和卵母细胞凋亡及颗粒细胞激素分泌的影响机制》文中研究说明哺乳动物超过99%的卵子在发育过程中都会经历闭锁性退化而不排卵,在促性腺激素的作用下,其中一些可以达到排卵前阶段,为了促进濒危物种以及基因优良畜禽体外培养卵子更好的应用,卵子发生和卵泡发育的机制尚需进一步研究。颗粒细胞分泌的激素和生长因子对卵泡发育起重要作用,同时卵母细胞分泌各种生长因子也可以调节颗粒细胞的增殖和分化。在卵泡液中含有多种不同水平的类固醇激素,比如雌激素、孕酮和雄激素,可以通过作用于颗粒细胞生长以及卵泡液的形成来影响卵巢的卵泡发育。近年来很多的研究表明,Wnt信号可以调节小鼠和人类的性腺发育和性别分化,并且可以调节激素的合成和分泌,对哺乳动物卵泡形成和发育以及卵巢功能的维持具有重要作用,可以参与调控卵泡闭锁等生理过程。Wnt5a和Wnt11属于非经典Wnt蛋白,它们在颗粒细胞中表达并且在整个卵泡发育过程中发挥特异的调控作用。当颗粒细胞Wnt5a失去活性的时候可以导致小鼠卵泡闭锁增加和排卵率降低。然而Wnt非典型通路对猪卵泡发育的作用尚未见系统报道,本文探究Wnt/PLC/Ca2+通路对猪卵泡发育过程中凋亡和激素分泌的影响。本试验通过抽吸法取得直径为2-5mm的卵泡中的卵泡液,并且收集颗粒细胞和卵母细胞,在体外培养液中添加一定剂量的Wnt/Ca2+通路中蛋白抑制剂或激活剂,包括Wnt蛋白抑制剂IWP-2、磷脂酶C（PLC）蛋白抑制剂U73122和激活剂m-3M3FBS以及PKCβ蛋白抑制剂Enzastaurin。通过显微镜观察卵母细胞成熟率;通过CCK8试验分别观察IWP-2、U73122、m-3M3FBS或Enzastaurin对颗粒细胞活力的影响。由荧光Ca2+指示剂Fluo3-AM监测颗粒细胞内钙离子含量,Ca2+指示剂Fura-2AM测定卵母细胞内钙离子含量。采用实时荧光定量（q RT-PCR）法检测通路相关基因以及激素分泌、细胞凋亡调控相关基因转录水平的表达;Annexin V-FITC法检测PLC抑制剂和激活剂对颗粒细胞的凋亡的影响。酶联免疫法（ELISA法）检测猪颗粒细胞雌二醇和孕酮的水平。Western Blot法检测凋亡调控若干蛋白、PLC四个亚基蛋白及三种钙离子敏感蛋白（PKCβ、CAMKⅡα、Caln A）的相对表达量。得到如下主要研究结果:1. 与对照组相比,0.05μM或5μM的IWP-2对猪颗粒细胞活力没有影响,0.1μM、0.5μM和2.5μM的IWP-2增加了猪颗粒细胞活力（P<0.05）。这表明Wnt配体在一定程度上抑制颗粒细胞活力。PLC抑制剂U73122的浓度不超过0.5μM时颗粒细胞的活力没有变化,浓度增加时细胞活力在4 h、24 h和48 h降低（P<0.05）,而PLC激活剂m-3M3FBS的添加使12 h之前的颗粒细胞活力随着浓度的增加呈现先升高再降低的趋势,m-3M3FBS浓度为0.5μM时活力最高（P<0.05）。这表明,PLC蛋白参与猪颗粒细胞的活力,并且一定程度上促进颗粒细胞活力。与对照组相比,0.25μM和2μM的Enzastaurin可以降低猪颗粒细胞的活力（P<0.05）。2.0.1-5μM的Wnt抑制剂IWP-2可以对卵母细胞成熟的抑制作用具有剂量依赖性,并且0.5μM的IWP-2抑制卵裂率（P<0.01）和囊胚率（P<0.01）。0.5μM的PLC抑制剂U73122提高了卵母细胞的成熟率（P<0.05）,降低了卵裂率（P<0.001）和囊胚率（P<0.01）;0.5μM PLC激活剂m-3M3FBS降低了卵母细胞成熟率（P<0.05）,提高了卵裂率（P<0.01）和囊胚率（P<0.01）。这说明Wnt配体在猪卵母细胞的成熟过程中可能具有促进作用,PLC蛋白可以抑制卵母细胞的成熟。3.0.5μM的IWP-2可以下调颗粒细胞（P<0.01）和卵母细胞（P<0.05）中的Ca2+的浓度。0.5μM的IWP-2处理猪颗粒细胞24 h降低了PLCB1（P<0.001）、PLCG1（P<0.01）和PLCZ1（P<0.001）的m RNA丰度;IWP-2处理猪卵母细胞44 h降低了PLCB1（P<0.001）、PLCD3（P<0.001）、PLCG1（P<0.001）和PLCZ1（P<0.001）基因的表达,同时降低了PLCD3（P<0.05）蛋白的表达。抑制剂U73122和激活剂m-3M3FBS对PLCB1 m RNA的最佳作用时间是4 h,最佳处理浓度是0.5μM。0.5μM U73122处理猪颗粒细胞4 h降低了PLCB1（P<0.05）、PLCD3（P<0.05）与PLCZ1（P<0.05）的m RNA表达,同时降低了PLCB1（p=0.001）和PLCG1（P<0.05）的相对蛋白丰度以及钙离子的浓度（P<0.001）。0.5μM的m-3M3FBS处理颗粒细胞4 h显着增加了PLCB1（P<0.05）、PLCD3（P<0.05）与PLCZ1（P<0.05）的m RNA表达,并升高了钙离子浓度（P<0.01）。与对照组相比,0.5μM的U73122处理猪卵母细胞44h后,PLCB1（P<0.001）、PLCD3（P<0.01）和PLCZ1（P<0.05）的m RNA丰度下降,钙离子浓度变化不大;用0.5μM m-3M3FBS处理猪卵母细胞44小时后,PLCB1（P<0.01）、PLCD3（P<0.001）、PLCG1（P<0.05）和PLCZ1（P<0.05）的m RNA丰度增加,PLCB1蛋白的丰度明显增加（P<0.05）,钙离子浓度增加（P<0.05）。IWP-2与U73122共同作用降低了颗粒细胞（P<0.001）和卵母细胞（P<0.05）中的钙离子水平,而IWP-2与m-3M3FBS共同作用则对颗粒细胞和卵母细胞的钙离子水平没有影响。结果表明,Wnt配体与PLC蛋白可以协同调节卵泡内钙离子水平的变化,能够增加胞质中Ca2+的增加。4. 在颗粒细胞中,抑制剂U73122降低了钙离子敏感蛋白PKCβ（P<0.05）、CAMKIIα（P<0.05）和Caln A（P<0.01）的表达丰度,激活剂m-3M3FBS升高了CAMKIIα蛋白（P<0.001）的表达量。在卵母细胞中,PLC蛋白对PKCβ和CAMKIIα蛋白具有正调控功能（P<0.05）,但是不影响Caln A的表达。在颗粒细胞中,抑制剂U73122可以下调CDC42（P<0.01）、NFATc1（P<0.01）和NFκB（P<0.01）的m RNA表达水平,同时对CTNNB有少许上调作用（P>0.05）;激活剂m-3M3FBS可以上调CDC42（P<0.05）、NFATc1（P<0.01）和NFκB（P<0.05）的m RNA表达水平,同时降低CTNNB（P<0.05）的表达。在卵母细胞中,PLC对下游基因具有上调作用,但是并不影响CTNNB的m RNA表达水平（P>0.05）。结果表明,PLC蛋白可以激活猪颗粒细胞和卵母细胞的钙离子敏感蛋白和下游基因,并且在颗粒细胞中可以抑制CTNNB的表达。5.0.5μM的IWP-2上调了调控猪颗粒细胞凋亡的BAK（P<0.001）、BAX（P<0.01）、CASP8（P<0.05）和TP53（P<0.05）基因的m RNA水平,同时Bak、Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表达增加（P<0.05）。0.5μM的IWP-2处理猪卵母细胞44 h之后,BAX（P<0.01）、CASP3（P<0.05）和TP53（P<0.01）基因的表达显着升高,同时抗凋亡基因BCL6（P<0.05）基因的表达降低;Bax（P<0.01）和Cleaved caspase3（P<0.05）蛋白的表达显着增加,Bcl-6（P<0.01）蛋白的表达降低。PLC活性变化可以抑制颗粒细胞的凋亡调控基因,并且在不同的时间对凋亡率的影响有所不同。0.5μM的PLC抑制剂U73122可以上调BAK（P<0.01）、BAX（P<0.05）和CASP3（P<0.01）的m RNA表达水平。0.5μM的U73122作用颗粒细胞4 h时早期凋亡率（P<0.05）和晚期凋亡率（P<0.05）达到最高。PLC激活剂m-3M3FBS可以上调抗凋亡基因BCL2（P<0.01）的m RNA水平,并且下调BAX（P<0.05）和CASP3（P<0.05）的m RNA表达;并降低Bax蛋白的表达,增加Bcl-2蛋白的表达。0.5μM的m-3M3FBS作用颗粒细胞4 h时早期凋亡率最高（P<0.05）,作用8 h时晚期凋亡率达到最高（P<0.05）。用0.5μM U73122培养猪卵母细胞44小时,与对照组相比,、、CASP3（P=0.001）、和的相对m RNA丰度增加,而的相对m RNA水平降低;、Cleaved和蛋白的表达上调。使用0.5μM m-3M3FBS培养猪卵母细胞44 h,与对照组相比,、、CASP3（p）、和TP53（p=0.001）的相对m RNA丰度降低,而BCL6的相对m RNA水平而升高（图4-6 D）;Bcl-6的蛋白表达丰度增加（P<0.05）,且P53的蛋白表达丰度降低。0.5μM的IWP-2与0.5μM的U73122于体外共同处理猪的颗粒细胞,与对照组相比,上调了BAK（P<0.01）、BAX（P<0.001）、CASP3（P<0.01）、CASP8（P<0.001）和TP53（P<0.05）的m RNA表达量,下调了BCL2（P<0.05）的m RNA表达水平。在猪颗粒细胞培养液中同时添加0.5μM的IWP-2和0.5μM的m-3M3FBS,与对照组相比,BAK（P<0.001）和CASP8（P<0.001）的m RNA表达水平降低。与对照组相比,2μM的Enzastaurin增加了BAK（P<0.001）、BAX（P<0.001）和CASP3（P<0.01）基因的表达,同时降低了BCL2（P<0.001）基因的表达;0.5μM的U73122和2μM的Enzastaurin共同作用增加了BAK（P<0.001）和BAX（P<0.05）基因的表达,同时降低了BCL2（P<0.01）基因的表达。2μM的Enzastaurin增加了Bax蛋白（P<0.05）的表达,降低了Bcl-2蛋白（P<0.01）的表达;0.5μM的U73122和2μM的Enzastaurin共同作用降低了Bcl-2蛋白（P<0.001）的表达。结果表明,Wnt/Ca2+通路中Wnt配体和PLC蛋白可以协同抑制猪颗粒细胞和卵母细胞的凋亡过程。0.5μM的U73122和2μM的Enzastaurin可以协同促进猪颗粒细胞的凋亡。6.0.5μM IWP-2可以促进猪颗粒细胞中雌二醇相关基因CYP17A1（P<0.01）、CYP19A1（P<0.01）、ER1（P<0.001）和ER2（P<0.01）的表达上调。0.5μM PLC抑制剂U73122可以上调猪颗粒细胞CYP11A1基因（P<0.05）,0.5μM PLC激活剂m-3M3FBS对激素调控的作用很小。0.5μM U73122处理颗粒细胞2 h、8 h、12 h、24 h、48 h后雌二醇分泌下降（P<0.05）,0.5μM m-3M3FBS处理猪颗粒细胞2h后雌二醇分泌下降（P<0.05）。0.5μM U73122处理猪颗粒细胞4 h增加了孕酮的分泌（P<0.05）,0.5μM m-3M3FBS处理猪颗粒细胞2 h和8 h后孕酮水平增加（P<0.05）。0.5μM的U73122处理猪颗粒细胞后,除了8 h（P>0.05）之外,各时间点雌二醇与孕酮的比例均下降（P<0.05）。使用0.5μM m-3M3FBS处理猪颗粒细胞2 h降低了雌二醇与孕酮的比例（P<0.05）。IWP-2和U73122共同作用提高了参与调节E2和P4的基因的m RNA表达水平,IWP-2与m-3M3FBS共同作用降低了CYP11A1的m RNA表达水平（P<0.01）,提高了CYP17A1（P<0.05）、CYP19A1（P<0.01）和ER1（P<0.05）的表达水平。与对照组相比,2μM Enzastaurin以及0.5μM U73122和2μM Enzastaurin共同作用均增加了猪颗粒细胞中CYP11A1基因（P<0.01）的表达和降低了CYP19A1（P<0.001）基因的表达。0.5μM U73122和2μM Enzastaurin共同作用比2μM Enzastaurin单独作用更明显地降低了猪颗粒细胞中CYP17A1基因的表达。研究表明,Wnt/Ca2+通路中Wnt配体和PLC蛋白可以共同调控猪颗粒细胞和卵母细胞的雌二醇（E2）和孕酮（P4）的激素水平。0.5μM的U73122和2μM的Enzastaurin可以协同调控三种激素相关基因CYP11A1、CYP17A1和CYP19A1。综上所述,Wnt/Ca2+信号通路中Wnt蛋白和PLC蛋白可发挥协同作用在猪的卵泡发育过程中具有抑制细胞凋亡和调节激素分泌的功能;Wnt/Ca2+信号关键蛋白PLC可以调控钙离子敏感蛋白和下游基因的表达。
二、Cloning and identification of apoptosis specific DNase inhibitor IXAD in Xenopus egg extract（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Cloning and identification of apoptosis specific DNase inhibitor IXAD in Xenopus egg extract（论文提纲范文）
（1）玉米籽粒发育调控基因ZmNPF7.9和ZmAPP1的克隆与功能分析（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 玉米籽粒发育概述 |
| 1.1.1 玉米籽粒的结构 |
| 1.1.2 玉米胚乳的发育 |
| 1.1.2.1 玉米胚乳的发育过程 |
| 1.1.2.2 玉米胚乳基底转移细胞的发育 |
| 1.1.3 玉米胚的发育 |
| 1.1.4 玉米籽粒发育调控 |
| 1.1.4.1 线粒体参与调控玉米籽粒的发育 |
| 1.1.4.2 核糖体生物合成相关基因调控玉米籽粒发育 |
| 1.1.4.3 醇溶蛋白相关基因调控玉米胚乳发育 |
| 1.1.4.4 物质转运相关基因调控玉米籽粒发育 |
| 1.2 硝酸盐转运蛋白家族研究进展 |
| 1.2.1 高等植物中硝酸盐转运蛋白和离子通道分类及生理特性 |
| 1.2.1.1 氮源的重要性 |
| 1.2.1.2 硝酸盐转运体的底物亲和力 |
| 1.2.1.3 硝酸盐转运体的分类 |
| 1.2.2 NRT1/PTR家族(NPF)蛋白的底物特异性 |
| 1.2.2.1 硝酸盐和多肽类转运 |
| 1.2.2.2 氯离子转运 |
| 1.2.2.3 钾离子转运 |
| 1.2.2.4 激素类转运 |
| 1.2.2.5 硫代葡萄糖苷和其他代谢物转运 |
| 1.2.3 硝酸盐转运蛋白的功能 |
| 1.2.3.1 硝酸盐感知/吸收与根系的发育 |
| 1.2.3.2 根-茎运输和硝酸盐分配 |
| 1.2.3.3 种子发育与氮素贮藏 |
| 1.3 GTPase蛋白家族研究进展 |
| 1.3.1 线粒体的结构和功能 |
| 1.3.2 线粒体的氧化磷酸化复合体 |
| 1.3.3 线粒体核糖体的结构 |
| 1.3.4 线粒体核糖体的组装 |
| 1.3.5 线粒体核糖体蛋白功能研究进展 |
| 1.3.6 P-Loop GTPase的结构和分类 |
| 1.3.7 GTPase的功能 |
| 1.4 目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株和载体 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要的仪器设备 |
| 2.1.5 引物合成与DNA测序 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 玉米基因组DNA的提取 |
| 2.2.2 Trizol法提取植物总RNA |
| 2.2.3 RNA的反转录 |
| 2.2.4 实时荧光定量PCR |
| 2.2.4.1 定量引物的设计 |
| 2.2.4.2 荧光定量PCR的反应体系及反应条件 |
| 2.2.5 种子活力检测 |
| 2.2.5.1 TTC染色 |
| 2.2.5.2 胚挽救实验 |
| 2.2.6 玉米籽粒储存蛋白检测 |
| 2.2.6.1 玉米籽粒总蛋白、醇溶蛋白、非醇溶蛋白的抽提 |
| 2.2.6.2 玉米籽粒总蛋白、醇溶蛋白、非醇溶蛋白的SDS-PAGE电泳检测 |
| 2.2.6.3 玉米籽粒总蛋白、醇溶蛋白、非醇溶蛋白的定量检测 |
| 2.2.7 玉米籽粒淀粉含量检测 |
| 2.2.8 玉米籽粒可溶性糖含量检测 |
| 2.2.9 玉米籽粒组织学切片与细胞学观察 |
| 2.2.9.1 材料的固定与包埋 |
| 2.2.9.2 石蜡切片 |
| 2.2.9.3 切片的脱蜡与染色观察 |
| 2.2.10 透射电镜样品制作 |
| 2.2.11 表达载体的构建 |
| 2.2.11.1 引物设计 |
| 2.2.11.2 PCR扩增目的片段 |
| 2.2.11.3 PCR产物回收纯化 |
| 2.2.11.4 酶切、连接反应 |
| 2.2.11.5 连接产物转化 |
| 2.2.11.6 PCR鉴定与测序验证 |
| 2.2.11.7 质粒提取 |
| 2.2.12 农杆菌介导的玉米遗传转化 |
| 2.2.12.1 CRISPR/Cas9表达载体构建 |
| 2.2.12.2 农杆菌EHA105感受态细胞转化 |
| 2.2.12.3 玉米遗传转化 |
| 2.2.13 线粒体复合物提取 |
| 2.2.14 线粒体复合物丰度分析 |
| 2.2.15 线粒体复合物I活性分析 |
| 2.2.16 ROS水平检测 |
| 2.2.16.1 DAB染色 |
| 2.2.16.2 NBT染色 |
| 2.2.16.3 H_2O_2含量测定 |
| 2.2.17 Western blot |
| 2.2.18 亚细胞定位 |
| 2.2.18.1 定位表达载体构建 |
| 2.2.18.2 表达载体质粒大量提取 |
| 2.2.18.3 玉米原生质体的提取与转化 |
| 2.2.19 ZmAPP1蛋白的原核表达与纯化 |
| 2.2.19.1 所需溶液配方 |
| 2.2.19.2 原核蛋白表达 |
| 2.2.19.3 His蛋白的纯化 |
| 2.2.20 ZmAPP1蛋白GTP水解活性测定 |
| 2.2.21 玉米胚乳线粒体分离 |
| 2.2.22 玉米胚乳核糖体分离与检测 |
| 2.2.23 原位杂交 |
| 2.2.23.1 材料的固定与包埋 |
| 2.2.23.2 切片 |
| 2.2.23.3 原位探针合成 |
| 2.2.23.4 原位探针半定量 |
| 2.2.23.5 原位杂交 |
| 2.2.24 硝酸盐含量测定 |
| 2.2.25 异源表达爪蟾卵母细胞实验 |
| 2.2.25.1 电生理实验 |
| 2.2.25.2 爪蟾卵母细胞对~(15)NO_3~-的吸收实验 |
| 2.2.25.3 爪蟾卵母细胞~(15)NO_3~-的动力学吸收实验 |
| 2.2.25.4 硝酸盐外排实验 |
| 2.2.26 转录组测序和数据分析 |
| 2.2.27 代谢组检测和数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 籽粒发育基因ZmNPF7.9的克隆与功能解析 |
| 3.1.1 npf7.9突变体鉴定及表型分析 |
| 3.1.1.1 npf7.9突变体果穗及籽粒表型分析 |
| 3.1.1.2 npf7.9突变体组织学切片分析及细胞形态学观察 |
| 3.1.1.3 npf7.9突变体植株表型分析 |
| 3.1.1.4 npf7.9突变体遗传分析 |
| 3.1.2 ZmNPF7.9基因克隆 |
| 3.1.2.1 粗定位 |
| 3.1.2.2 精细定位 |
| 3.1.2.3 等位测试 |
| 3.1.3 ZmNPF7.9蛋白定位 |
| 3.1.4 ZmNPF7.9基因表达模式分析 |
| 3.1.5 npf7.9胚乳基底传递细胞观察 |
| 3.1.6 电生理实验 |
| 3.1.7 ~(15)N-硝酸盐吸收实验 |
| 3.1.8 ~(15)N-硝酸盐外排实验 |
| 3.1.9 淀粉及硝酸盐含量检测 |
| 3.1.10 RNA-seq数据分析 |
| 3.1.11 代谢组数据分析 |
| 3.2 籽粒发育基因ZmAPP1的克隆与功能解析 |
| 3.2.1 app1突变体鉴定及表型分析 |
| 3.2.1.1 app1突变体果穗及籽粒表型分析 |
| 3.2.1.2 app1突变体遗传分析 |
| 3.2.1.3 app1突变体组织学切片分析及细胞形态学观察 |
| 3.2.1.4 app1突变体籽粒萌发及胚挽救实验 |
| 3.2.2 app1突变体生化成分检测 |
| 3.2.2.1 app1突变体醇溶蛋白检测 |
| 3.2.2.2 app1淀粉含量及可溶性糖检测 |
| 3.2.3 ZmAPP1基因的克隆和等位测试 |
| 3.2.3.1 ZmAPP1粗定位 |
| 3.2.3.3 ZmAPP1精细定位 |
| 3.2.3.4 ZmAPP1CRISPR/Cas9转基因株系鉴定和等位测试 |
| 3.2.4 ZmAPP1蛋白结构、亚细胞定位及表达模式分析 |
| 3.2.4.1 ZmAPP1基因表达模式分析 |
| 3.2.4.2 ZmAPP1蛋白结构分析 |
| 3.2.4.3 ZmAPP1蛋白亚细胞定位 |
| 3.2.5 ZmAPP具有GTP酶水解活性 |
| 3.2.5.1 ZmAPP1蛋白原核表达 |
| 3.2.5.2 ZmAPP1酶活动力学曲线检测 |
| 3.2.6 ZmAPP1可能参与线粒体复合体的组装 |
| 3.2.7 ZmAPP1蛋白影响线粒体功能和超微结构 |
| 3.2.7.1 线粒体基因表达量分析 |
| 3.2.7.2 线粒体蛋白表达分析 |
| 3.2.7.3 线粒体复合体的丰度及活性检测 |
| 3.2.7.4 app1突变体交替氧化酶基因表达量分析 |
| 3.2.7.5 线粒体超微结构观察 |
| 3.2.8 app1突变体细胞程序化死亡提前 |
| 3.2.8.1 app1胚乳中ROS过量积累 |
| 3.2.8.2 app1籽粒的珠心、糊粉层细胞出现严重的DNA损伤 |
| 3.2.9 RNA-seq数据分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 胚乳传递细胞层特异表达基因ZmNPF7.9在玉米籽粒发育过程发挥关键作用 |
| 4.2 ZmNPF7.9可能存在其他潜在的转运底物 |
| 4.3 ZmNPF7.9具有潜在的应用价值 |
| 4.4 ZmAPP1参与线粒体核糖体的组装 |
| 4.5 ZmAPP1影响线粒体功能 |
| 4.6 ZmAPP1蛋白调控玉米籽粒发育 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（2）绵羊卵母细胞成熟过程中3’-UTR调控mRNA翻译非经典机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 mRNA翻译起始调控研究进展 |
| 1 哺乳动物减数分裂成熟过程中mRNA翻译起始的调控 |
| 1.1 简介 |
| 1.2 哺乳动物减数第一次分裂前期的阻滞 |
| 1.3 mRNA翻译起始区的性质 |
| 1.4 哺乳动物减数分裂成熟过程中RNA结合蛋白的调节 |
| 2 3′-UTR在基因表达中的作用 |
| 2.1 ARE的3′-UTR可调节mRNA的稳定性,定位和翻译 |
| 2.2 RNA结合蛋白与3′-UTR顺式作用元件结合,介导多重相反的功能 |
| 2.3 3′-UTR调节蛋白质-蛋白质的相互作用 |
| 2.4 效应蛋白从3′-UTR转移到蛋白质的机制 |
| 2.5 3′-UTR顺式作用元件通常是重复的,并且经常协同作用 |
| 3 3′-UTR对翻译起始的调控 |
| 3.1 PABP对翻译起始的调控 |
| 3.2 3′-UTR决定mRNA的命运 |
| 3.3 PABP通过与Poly(A)尾的结合促进翻译起始并稳定转录本 |
| 3.4 APA对 mRNA稳定性和翻译起始的调控 |
| 4 展望 |
| 第二章 实验研究 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 主要实验耗材 |
| 2.4 实验仪器设备 |
| 2.5 抗体 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 操作液与培养液的配制 |
| 3.2 绵羊肝脏组织RNA的提取 |
| 3.3 绵羊肝脏组织RNA反转录成cDNA |
| 3.4 载体构建与位点突变 |
| 3.5 RNA的体外转录与纯化 |
| 3.6 卵巢的收集和卵母细胞的选择 |
| 3.7 绵羊卵丘细胞的去除 |
| 3.8 绵羊卵母细胞的显微注射 |
| 3.9 Western blot |
| 3.10 数据统计分析 |
| 4 实验结果及分析 |
| 4.1 近端PAS对 CPEB1 3′-UTR介导的目的基因翻译活性的影响 |
| 4.2 PAS的位置对CPEB1 3′-UTR介导的目的基因翻译激活效率的影响 |
| 4.3 PAS的数量对CPEB1 3′-UTR介导的目的基因翻译激活效率的影响 |
| 4.4 CPE与 PAS的距离对CPEB1 3′-UTR介导的目的基因翻译抑制效率的影响 |
| 4.5 CPE的数量和位置对BTG4 3′-UTR介导的目的基因翻译抑制效率的影响 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（3）外泌体Dvl3 mRNA调节Wnt通路对关节滑膜增殖、炎症的作用及其机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 Dvl3在RA患者以及小鼠CIA模型关节滑膜中的表达情况 |
| 一、前言 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 六、结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 外泌体Dvl3 mRNA对RA-FLS增殖、凋亡、迁移以及炎症因子分泌的影响 |
| 一、前言 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 六、结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 外泌体Dvl3 mRNA对胶原诱导关节炎小鼠模型关节炎症的影响 |
| 一、前言 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 六、结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 外泌体Dvl3 mRNA通过调控Wnt途径参与影响RA-FLS生物学行为 |
| 一、前言 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 六、结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 复杂Wnt信号通路网络中的舞者：Dvl蛋白 |
| 参考文献 |
| 在读期间论文发表和参与科研工作情况 |
| 致谢 |
（4）小鼠卵母细胞减数分裂过程中母源mRNA的翻译调控机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 哺乳动物的卵母细胞发生和减数分裂过程 |
| 1.1.1 卵泡的发育 |
| 1.1.2 卵母细胞的减数分裂过程 |
| 1.2 poly(A)尾巴的产生与加工 |
| 1.2.1 poly(A)尾巴的形成概述 |
| 1.2.2 经典和非经典PAP |
| 1.2.3 CPSF复合体的组分和功能 |
| 1.2.4 调节poly(A)尾的产生和加工的其他蛋白 |
| 1.3 mRNA加尾和翻译的时空调控 |
| 1.4 PAPα自身的活性调节介导的翻译激活 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验仪器、耗材及试剂 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验耗材 |
| 2.1.3 常用实验试剂 |
| 2.1.4 常用实验试剂配方 |
| 2.2 动物实验 |
| 2.2.1 野生型小鼠的获得和饲养 |
| 2.2.2 卵母细胞收集与体外培养 |
| 2.2.3 小鼠超数排卵 |
| 2.3 生化与分子实验 |
| 2.3.1 质粒的构建 |
| 2.3.1.1 质粒的提取、DNA凝胶回收与PCR清洁 |
| 2.3.1.2 常规表达载体 |
| 2.3.1.3 PAPα突变体 |
| 2.3.1.4 CPSF4 突变体 |
| 2.3.1.5 3'-UTR相关载体 |
| 2.3.1.6 持续激活的CDK1和MEK1 |
| 2.3.1.7 点突变载体的构建 |
| 2.3.2 线性化与体外转录 |
| 2.3.3 显微注射 |
| 2.3.4 RNA逆转录 |
| 2.3.5 荧光实时定量PCR(qRT-PCR) |
| 2.3.6 PAT分析 |
| 2.3.7 核糖核蛋白免疫沉淀(RIP)分析 |
| 2.3.8 细胞培养 |
| 2.3.9 转染 |
| 2.3.10 免疫共沉淀 |
| 2.3.11 免疫印迹法(WB) |
| 2.4 形态学实验 |
| 2.4.1 卵母细胞免疫荧光染色 |
| 2.4.2 HPG染色 |
| 2.5 统计与分析 |
| 3 小鼠卵母细胞中mRNA 3'-UTR介导的组合代码对翻译的调控 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 近端和远端PAS均能调节GV时期Cpeb1 3'-UTR的翻译活性 |
| 3.2.2 CPSF4 参与了近端PAS介导的卵母细胞胞质翻译 |
| 3.2.3 CPE通过抑制附近的PAS来抑制GV时期卵母细胞中转录本的翻译 |
| 3.2.4 CPE介导的翻译抑制的效率受到CPEs与 PAS相对位置的影响 |
| 3.2.5 Btg4 3'-UTR上的 CPE对于GV时期的翻译抑制是必需的 |
| 3.2.6 GV时期Cnot6l的翻译主要受近端的PAS1 调节 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 4 卵母细胞中PAPα的磷酸化触发母源mRNA的翻译激活 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 PAPα在卵母细胞成熟过程中起着关键作用 |
| 4.2.2 PAPα对于卵母细胞减数分裂正常的纺锤体组装和染色体排列是必需的 |
| 4.2.3 PAPα~(△PAP)的过表达导致mRNA poly(A)尾延伸和翻译激活的失败 |
| 4.2.4 CDK1和ERK1/2 共同调节卵母细胞成熟过程中的PAPα的磷酸化 |
| 4.2.5 PAPα的 RRM对于它与CPSF复合体之间的相互作用有着重要作用 |
| 4.2.6 在成熟的小鼠卵母细胞中的PAPα的磷酸化促进其自身的活性 |
| 4.2.7 PAPα通过正反馈通路增强其自身mRNA的聚腺苷酸化和翻译 |
| 4.2.8 小结和讨论 |
| 5 总结与讨论 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 讨论 |
| 6 文献综述 聚腺苷酸化的分子调控与相关疾病 |
| 6.1 聚腺苷酸化对血液性疾病的影响 |
| 6.2 聚腺苷酸化对细胞增殖和肿瘤的影响 |
| 6.3 聚腺苷酸化对免疫疾病的影响 |
| 6.4 聚腺苷酸化对神经系统疾病的影响 |
| 6.5 聚腺苷酸化对内分泌疾病的影响 |
| 6.6 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 抗体信息 |
| 附录二 相关引物序列 |
| 作者简历 |
| 答辩决议书 |
（5）SUMO化与猪卵母细胞体外成熟、胚胎发育及孤雌胚胎发育相关研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 综述 |
| 1.1 蛋白质翻译后修饰 |
| 1.2 SUMO化修饰过程及功能 |
| 1.3 SUMO化的相关修饰功能 |
| 1.4 SUMO调节活性氧的功能 |
| 1.5 SUMO化与细胞凋亡 |
| 1.6 卵母细胞成熟 |
| 1.7 透明带(ZP)的性质 |
| 1.8 精-卵结合机制 |
| 1.9 体外胚胎培养 |
| 1.10 孤雌激活 |
| 1.11 本试验的研究目的及意义 |
| 第二章 类泛素化E1激活酶UBA2对猪卵母细胞体外成熟、凋亡及孤雌激活的影响 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 类泛素化E2结合酶UBC9对猪卵母细胞体外成熟、凋亡及胚胎发育的影响 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 活性氧对猪卵母细胞SUMO-1表达及精-卵结合的影响 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 英文简写缩略表 |
| 附录二 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（6）igf2bp3在斑马鱼胚胎发育中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 前言 |
| 1 母源因子概述 |
| 1.1 母源因子简介 |
| 1.2 母源突变体的构建 |
| 1.3 母源因子的功能 |
| 2 母源合子转换概述 |
| 2.1 母源RNA的降解 |
| 2.2 合子基因组激活 |
| 3 IGF2BPs基因家族概述 |
| 3.1 IGF2BPs简介 |
| 3.2 IGF2BPs基因家族研究进展 |
| 4 RNA甲基化修饰概述 |
| 4.1 RNA甲基化修饰简介 |
| 4.2 m~6ARNA甲基化研究进展 |
| 5 生殖质及生殖细胞概述 |
| 5.1 生殖质及生殖细胞简介 |
| 5.2 生殖质及生殖细胞研究进展 |
| 6 实验动物斑马鱼的研究背景 |
| 7 研究目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 实验动物 |
| 2 实验所用载体和菌株 |
| 3 仪器设备 |
| 4 实验试剂 |
| 5 RNA提取 |
| 6 RNA逆转录 |
| 7 荧光定量PCR |
| 8 斑马鱼胚胎转录组测序 |
| 9 基因组DNA提取 |
| 10 DNA纯化回收 |
| 11 斑马鱼胚胎整体原位杂交(WISH) |
| 12 斑马鱼igf2bp3基因突变体构建 |
| 13 斑马鱼敲除igf2bp3靶位点有效性验证 |
| 14 斑马鱼igf2bp3突变体筛选 |
| 15 RNA稳定性实验 |
| 16 质粒构建 |
| 17 免疫荧光 |
| 18 蛋白互作实验 |
| 19 RNA结合蛋白免疫沉淀 |
| 20 RNA甲基化免疫沉淀 |
| 21 体外转录合成过表达mRNA和挽救实验 |
| 22 组织切片苏木精-伊红(HE)染色 |
| 23 蛋白免疫印迹 |
| 24 数据分析 |
| 25 实验所用引物 |
| 第三章 结果 |
| 1 Igf2bp3维持母源RNA稳定以保证胚胎正常发育 |
| 1.1 igf2bp3mRNA的表达模式 |
| 1.2 igf2bp3突变体构建及验证 |
| 1.3 母源igf2bp3缺失导致胚胎发育缺陷 |
| 1.4 母源igf2bp3突变体中细胞骨架组装出现缺陷 |
| 1.5 母源igf2bp3突变体胚胎中的母源RNA降解更快 |
| 1.6 igf2bp3突变不影响卵母细胞的发生 |
| 1.7 Igf2bp3蛋白结合母源mRNA调节其稳定性 |
| 1.8 过表达igf2bp3mRNA可以延缓母源RNA的降解 |
| 2 m~6A读取器Igf2bp3通过调控m~6A依赖的基因表达实现种质组装 |
| 2.1 Igf2bp3与Buc互作并共定位在种质中 |
| 2.2 母源igf2bp3突变导致生殖质组装与生殖细胞发生出现缺陷 |
| 2.3 igf2bp3突变对卵母细胞中生殖质mRNA的定位和表达影响较小 |
| 2.4 Igf2bp3调控早期胚胎中生殖质mRNA的表达 |
| 2.5 Igf2bp3调控m~6A修饰基因的表达 |
| 2.6 Igf2bp3蛋白结合m~6A修饰的生殖质mRNA并调节其稳定性 |
| 第四章 讨论 |
| 1 Igf2bp3维持母源RNA稳定以保证胚胎正常发育 |
| 2 m~6A读取器Igf2bp3通过调控m~6A依赖的基因表达实现种质组装 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（7）细胞中化学修饰蛋白及生物大分子相互作用的核磁共振研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 细胞内生物大分子原位核磁共振 |
| 1.2 不同细胞内的In-cell NMR研究 |
| 1.2.1 原核细胞In-cell NMR |
| 1.2.2 真核细胞In-cell NMR |
| 1.3 核磁共振检测方法 |
| 1.3.1 核磁共振简介 |
| 1.3.2 化学位移 |
| 1.3.3 ~(19)F核磁共振 |
| 1.3.4 ~(15)N-~1H HSQC |
| 1.3.5 扩散 |
| 1.3.6 弛豫 |
| 1.4 主要的研究方向 |
| 1.4.1 细胞内蛋白质的化学修饰 |
| 1.4.2 细胞内蛋白质的相互作用 |
| 1.4.3 细胞内核酸G-四链体的研究 |
| 第二章 利用In-cell NMR方法监测磷酸化依赖的α-突触核蛋白降解 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验样品与实验方法 |
| 2.2.1 实验试剂与实验仪器 |
| 2.2.2 α-syn及其突变体的基本性质 |
| 2.2.3 构建α-syn突变体质粒 |
| 2.2.4 质粒的转化及单克隆菌株获取 |
| 2.2.5 蛋白质的表达 |
| 2.2.6 蛋白质样品纯化 |
| 2.2.7 α-syn的129位丝氨酸磷酸化 |
| 2.2.8 显微注射实验 |
| 2.2.9 电穿孔实验 |
| 2.2.10 细胞裂解液的制备 |
| 2.2.11 荧光成像 |
| 2.2.12 蛋白印记法Western-Blot实验 |
| 2.2.13 NMR实验 |
| 2.2.14 流式细胞仪检测细胞存活率 |
| 2.2.15 数据处理 |
| 2.3. 结果与讨论 |
| 2.3.1 α-syn的129位丝氨酸磷酸化 |
| 2.3.2 pS129 α-syn在细胞裂解液中的降解和去磷酸化 |
| 2.3.3 pS129 α-syn在非洲爪蟾卵母细胞中的降解和去磷酸化 |
| 2.3.4 pS129 α-syn在SK-N-SH细胞中的降解和去磷酸化 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 细胞环境对蛋白质相互作用的调控 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 样品与实验方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 A34F GB1蛋白质及其突变体的基本性质 |
| 3.2.3 A34F GB1蛋白质及其突变体的表达 |
| 3.2.4 A34F GB1及其突变体的纯化 |
| 3.2.5 In-cell NMR样品的准备 |
| 3.2.6 细胞裂解液的制备 |
| 3.2.7 NMR实验 |
| 3.2.8 数据处理 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 A34F GB1蛋白质二聚体及其19F标记 |
| 3.3.2 非洲爪蟾卵母细胞中的A34F GB1 |
| 3.3.3 A34F GB1在卵母细胞中的解离常数 |
| 3.3.4 细胞环境对A34F GB1二聚相互作用的影响 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 G-四链体在细胞内稳定性及其与配体相互作用的NMR研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 样品与实验方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 G-四链体的准备 |
| 4.2.3 稀溶液及细胞裂解液中的样品准备 |
| 4.2.4 细胞内实验样品准备 |
| 4.2.5 NMR实验 |
| 4.2.6 圆二色光谱(Circular Dichroism,CD)实验 |
| 4.2.7 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验 |
| 4.2.8 荧光成像 |
| 4.2.9 蛋白酶K消化处理细胞裂解液 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 G-四链体的~(19)F标记 |
| 4.3.2 G-四链体在细胞裂解液中的稳定性 |
| 4.3.3 G-四链体在哺乳动物细胞裂解液中稳定性的影响因素 |
| 4.3.4 G-四链体在Hela细胞及非洲爪蟾卵母细胞中的研究 |
| 4.3.5 MHT24与配体小分子在细胞中的相互作用 |
| 4.4 小结 |
| 第五章总结与展望 |
| 5.1 In-cell NMR是监测pS129 α-syn去磷酸化和降解的有效手段 |
| 5.2 细胞环境中非特异性相互作用会对蛋白质二聚相互作用产生影响 |
| 5.3 细胞环境会影响G-四链体与配体的相互作用 |
| 5.4 展望 |
| 5.4.1 In-cell NMR中细胞活力状态的保持 |
| 5.4.2 在更低的生理浓度下检测生物大分子 |
| 5.4.3 克服In-cell NMR信号分辨率低的问题 |
| 5.4.4 在亚细胞水平进行In-cell NMR研究 |
| 5.4.5 其它方面 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录A 实验室常用培养基及溶液等的配置 |
| 附表A.1 LB (Luria-Bertani)培养基 |
| 附表A.2 LB固态培养基 |
| 附表A.3 M9培养基 |
| 附表A.4 TY (Trypton-Yeast)培养基 |
| 附表A.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE) |
| 附表A.6 SDS-PAGE电泳缓冲液(Runningbuffer) |
| 附表A.7 5×SDS-PAGE上样缓冲液(Loading buffer) |
| 附表A.8 考马斯亮蓝R-250蛋白质染色液 |
| 附表A.9 考马斯亮蓝R-250染色后凝胶脱色液 |
| 附表A.10 5×TBE缓冲液 |
| 附表A.11 15%非变性聚丙烯酰胺凝胶(Native-PAGE) |
| 附表A.12 10×DNA上样缓冲液(Loading buffer) |
| 附录B 实验室常用的大肠杆菌感受态及质粒的获取 |
| 附录B.1 大肠杆菌细胞感受态制备(氯化钙法) |
| 附录B.2 质粒的扩增及提取(以AxyPrep质粒DNA小量试剂盒为例) |
| 附录C 英文简写索引 |
| 致谢 |
| 作者简介及在学期间发表的学术论文与研究成果 |
（8）利用gsdf敲除青鳉研究Igf2bp3和42Sp50因子在卵细胞发育中的潜在作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 Igf2bp3的研究进展 |
| 1.2 IMP家族简介 |
| 1.3 gsdf,amh与多囊卵巢综合征(PCOS) |
| 1.4 42sp50的研究进展 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 实验动物青鳉品系的维持 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验耗材和仪器 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 DNA,RNA的提取 |
| 2.4.2 样品鉴定 |
| 2.4.3 样品组织包埋 |
| 2.4.4 石蜡切片&冰冻切片制备 |
| 2.4.5 RNA反转录 |
| 2.4.6 分子克隆 |
| 2.4.7 实时定量PCR |
| 2.4.8 HE染色 |
| 2.4.9 双色荧光免疫组化 |
| 2.4.10 双色荧光原位杂交 |
| 2.4.11 化学免疫组化 |
| 2.4.12 EdU细胞增殖检测 |
| 2.4.13 TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(南京诺唯赞) |
| 2.4.14 蛋白质组学分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 青鳉鉴定结果 |
| 3.1.1 青鳉组织学鉴定雌雄 |
| 3.1.2 青鳉遗传学鉴定雌雄 |
| 3.1.3 青鳉遗传学鉴定gsdf基因型 |
| 3.2 转录组分析差异,蛋白质组析学分析 |
| 3.3 Igf2bp3在青鱂性腺中的表达情况 |
| 3.3.1 Igf2bp3在进化过程高度保守 |
| 3.3.2 Igf2bp3主要表达在发育性卵巢中 |
| 3.4 Igf2bp3在小鼠性腺中的表达情况 |
| 3.5 Igf2bp3在人性腺中的表达情况以及睾丸癌卵巢癌中的特异性表达 |
| 3.6 PCOS卵巢中IGF2BP3 高表达的卵母细胞增生 |
| 3.7 青鳉42Sp50在XX和 XY型 gsdf纯和突变型卵巢中的表达显着差异 |
| 3.8 eEF1α在性腺分化过程中的表达XY性腺高于XX性腺 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 gsdf调控igf2bp3 介导卵母细胞发育 |
| 4.2 gsdf缺陷卵巢具有异质性 |
| 4.3 Gsdf可能结合amhr2 调控Igf2bp3,介导卵原细胞向初级卵母细胞的发育和分化。 |
| 4.4 gsdf敲除后导致42Sp50 异常升高 |
| 4.5 e EF1α和42Sp50对Gsdf信号可能有不同应答机制。 |
| 4.6 总结 |
| 第五章 参考文献 |
| 第六章 致谢 |
（9）HMG2L1在非小细胞肺癌的表达及作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 HMG2L1 在非小细胞肺癌的表达及临床意义 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 收集病例及标本的检测情况 |
| 2.3.2 HMG2L1 的表达与非小细胞肺癌临床病理特征的相关性分析 |
| 2.3.3 随访分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第3章 HMG2L1 在非小细胞肺癌的功能及机制研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 人HMG2L1 基因干扰慢病毒包装及验证 |
| 3.2.2 细胞学实验 |
| 3.2.3 分子生物学实验（每一步尽量在冰上进行） |
| 3.2.4 蛋白质免疫印迹实验（Western Blot，WB） |
| 3.2.5 统计学方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 构建HMG2L1-shRNA慢病毒 |
| 3.3.2 在非小细胞肺癌细胞中敲低HMG2L1基因表达 |
| 3.3.3 HMG2L1 对非小细胞肺癌细胞增殖能力的影响 |
| 3.3.4 HMG2L1 对非小细胞肺癌细胞迁移能力的影响 |
| 3.3.5 HMG2L1 对非小细胞肺癌细胞侵袭能力的影响 |
| 3.3.6 HMG2L1 在非小细胞肺癌细胞中的作用机制探索 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第4章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 进一步工作的方向 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（10）Wnt/PLC/Ca2+通路对猪卵泡颗粒细胞和卵母细胞凋亡及颗粒细胞激素分泌的影响机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 颗粒细胞和卵母细胞在哺乳动物卵泡闭锁和激素分泌中的作用 |
| 1.1.1 哺乳动物卵巢的基本结构和功能 |
| 1.1.2 卵泡发育的基本过程 |
| 1.1.3 卵泡发育的调控途径 |
| 1.1.4 颗粒细胞在卵泡发育中的作用 |
| 1.1.5 卵母细胞的发育以及在卵泡发育中的作用 |
| 1.1.6 颗粒细胞与卵母细胞的互作 |
| 1.2 Wnt-Ca~(2+)信号通路对卵泡发育的影响 |
| 1.2.1 Wnt通路概述以及Wnt-Ca~(2+)通路的组成 |
| 1.2.2 Wnt-Ca~(2+)通路在哺乳动物生理病理活动中的调节作用 |
| 1.2.3 Wnt-Ca~(2+)与Wnt典型通路的互作 |
| 1.2.4 Wnt-Ca~(2+)与其它信号通路的关系 |
| 1.3 研究目的和意义 |
| 第二章 Wnt/PLC/Ca~(2+)信号变化对猪颗粒细胞活力和卵母细胞成熟的调控 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要试验仪器 |
| 2.2.3 试验动物来源 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 猪卵巢的采集 |
| 2.3.2 猪颗粒细胞和卵母细胞的培养 |
| 2.3.3 猪颗粒细胞的鉴定 |
| 2.3.4 CCK8法测定颗粒细胞活力 |
| 2.3.5 卵母细胞成熟的判定 |
| 2.3.6 孤雌激活和早期胚胎培养 |
| 2.3.7 早期胚胎发育的评定 |
| 2.3.8 统计学数据分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 猪颗粒细胞的鉴定 |
| 2.4.2 不同浓度IWP-2对猪颗粒细胞活力的影响 |
| 2.4.3 不同浓度抑制剂U73122对颗粒细胞活力的影响 |
| 2.4.4 不同浓度激活剂m-3M3FBS对颗粒细胞活力的影响 |
| 2.4.5 不同浓度IWP-2对猪卵母细胞第一极体排出率的影响 |
| 2.4.6 不同浓度抑制剂U73122 或激活剂m-3M3FBS对卵母细胞成熟的影响. |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 IWP-2对Wnt/PLC/Ca~(2+)通路的抑制、对凋亡的促进及其对颗粒细胞激素的调控 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 主要试验仪器 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 猪卵巢的采集以及猪颗粒细胞和卵母细胞的培养 |
| 3.3.2 猪颗粒细胞和卵母细胞钙离子浓度的测定 |
| 3.3.3 猪颗粒细胞RNA提取和反转录 |
| 3.3.4 实时荧光定量PCR检测凋亡相关基因和激素调控基因的表达水平 |
| 3.3.5 Western Blot法检测凋亡相关蛋白和PLC四种亚基蛋白表达水平 |
| 3.3.6 统计学数据分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 IWP-2对猪颗粒细胞和卵母细胞中Ca~(2+)浓度的影响 |
| 3.4.2 IWP-2对猪颗粒细胞和卵母细胞凋亡的影响 |
| 3.4.3 IWP-2对颗粒细胞雌二醇和孕酮调控基因的影响 |
| 3.4.4 IWP-2 对猪颗粒细胞和卵母细胞PLC四种亚基基因和蛋白表达的影响. |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 PLC蛋白对猪卵泡发育过程中细胞凋亡、激素分泌和Wnt/Ca~(2+)信号通路的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 主要试剂 |
| 4.2.2 主要试验仪器 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 猪卵巢的采集以及颗粒细胞和卵母细胞的培养 |
| 4.3.2 颗粒细胞和卵母细胞的总RNA提取和反转录 |
| 4.3.3 实时荧光定量PCR检测凋亡、激素和Wnt/Ca~(2+)通路若干基因的表达 |
| 4.3.4 Western Blot法检测凋亡和Wnt/Ca~(2+)通路相关蛋白的表达 |
| 4.3.5 Annexin V-FITC法检测猪颗粒细胞凋亡 |
| 4.3.6 酶联免疫法(ELISA法)测定猪雌二醇和孕酮的含量 |
| 4.3.7 猪颗粒细胞和卵母细胞钙离子浓度测定 |
| 4.3.8 统计学数据分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 PLC蛋白对猪颗粒细胞和卵母细胞凋亡的调控 |
| 4.4.2 PLC蛋白对猪颗粒细胞雌二醇和孕酮分泌的调控 |
| 4.4.3 PLC蛋白对猪颗粒细胞和卵母细胞Wnt/Ca~(2+)信号中PLC四个亚基、Ca~(2+)浓度、三个钙离子敏感蛋白和若干下游基因的调控 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 IWP-2与U73122或m-3M3FBS互作对猪卵泡Ca~(2+)的调节以及对颗粒细胞凋亡和激素的调节作用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 主要试剂 |
| 5.2.2 主要试验仪器 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 猪卵巢的采集以及颗粒细胞和卵母细胞的培养 |
| 5.3.2 猪颗粒细胞和卵母细胞钙离子浓度检测 |
| 5.3.3 颗粒细胞总RNA提取和反转录 |
| 5.3.4 实时荧光定量PCR检测颗粒细胞凋亡和激素调控基因相对表达 |
| 5.3.5 统计学数据分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 IWP-2与U73122或m-3M3FBS相互作用对猪颗粒细胞和卵母细胞Ca~(2+)浓度的影响 |
| 5.4.2 IWP-2与U73122或m-3M3FBS相互作用对颗粒细胞凋亡调控基因的影响 |
| 5.4.3 IWP-2与U73122或m-3M3FBS相互作用对颗粒细胞激素调控基因的影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 Enzastaurin或 Enzastaurin与 U73122 互作对猪颗粒细胞激素和凋亡的调节作用 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 试验材料 |
| 6.2.1 主要试剂 |
| 6.2.2 主要试验仪器 |
| 6.3 试验方法 |
| 6.3.1 猪卵巢的采集以及颗粒细胞的培养 |
| 6.3.2 猪颗粒细胞总RNA提取和反转录 |
| 6.3.3 实时荧光定量PCR检测猪颗粒细胞凋亡和激素调控基因相对表达 |
| 6.3.4 Western Blot法检测猪颗粒细胞PKC蛋白表达的影响 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 Enzastaurin对猪颗粒细胞活力的影响 |
| 6.4.2 Enzastaurin以及Enzastaurin与 U73122 互作对猪颗粒细胞凋亡相关基因和蛋白表达的影响 |
| 6.4.3 Enzastaurin以及Enzastaurin与 U73122 互作对猪颗粒细胞雌二醇和孕酮激素相关基因表达的影响 |
| 6.4.4 Enzastaurin以及Enzastaurin与 U73122 互作对PKCβ蛋白表达的影响 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 第七章 结论与创新点 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 下一步研究工作 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、Cloning and identification of apoptosis specific DNase inhibitor IXAD in Xenopus egg extract（论文参考文献）
- [1]玉米籽粒发育调控基因ZmNPF7.9和ZmAPP1的克隆与功能分析[D]. 魏一鸣. 山东农业大学, 2021
- [2]绵羊卵母细胞成熟过程中3’-UTR调控mRNA翻译非经典机制研究[D]. 张茹静. 内蒙古大学, 2021
- [3]外泌体Dvl3 mRNA调节Wnt通路对关节滑膜增殖、炎症的作用及其机制[D]. 谭卫星. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [4]小鼠卵母细胞减数分裂过程中母源mRNA的翻译调控机制研究[D]. 江俊超. 浙江大学, 2021(01)
- [5]SUMO化与猪卵母细胞体外成熟、胚胎发育及孤雌胚胎发育相关研究[D]. 徐妲. 延边大学, 2020(05)
- [6]igf2bp3在斑马鱼胚胎发育中的功能研究[D]. 任帆. 华中农业大学, 2020(01)
- [7]细胞中化学修饰蛋白及生物大分子相互作用的核磁共振研究[D]. 郑稳稳. 中国科学院大学(中国科学院武汉物理与数学研究所), 2020(02)
- [8]利用gsdf敲除青鳉研究Igf2bp3和42Sp50因子在卵细胞发育中的潜在作用[D]. 武小雯. 上海海洋大学, 2020(03)
- [9]HMG2L1在非小细胞肺癌的表达及作用研究[D]. 康秀华. 南昌大学, 2020(08)
- [10]Wnt/PLC/Ca2+通路对猪卵泡颗粒细胞和卵母细胞凋亡及颗粒细胞激素分泌的影响机制[D]. 陈华丽. 西北农林科技大学, 2020