抗人CTLA-4抗体的制备及功能研究

论文摘要

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）是表达于T细胞表面的一种抑制T细胞活化的负调节分子,在恶性肿瘤及一些自身免疫疾病的发生发展中发挥重要作用。肿瘤细胞可以利用CTLA-4实现免疫逃逸,CTLA-4的阻断剂如单克隆抗体能够重新激活免疫系统,达到抗肿瘤的目的。本研究旨在利用鼠源及人源抗体库技术获取靶向人CTLA-4的单克隆抗体。合成人CTLA-4胞外区基因,扩增得到胞外区基因片段,插入大肠杆菌表达载体pET28a,构建了编码人CTLA-4胞外区基因的重组质粒pET28a-CTLA4。将重组质粒转化至大肠杆菌Rosseta（DE3）中,在IPTG终浓度为0.5 mmol/L、于37℃诱导4 h的条件下,实现了人CTLA-4胞外区重组蛋白的高效表达,表达产物主要为包涵体。对诱导温度、诱导时间及诱导剂IPTG终浓度三个因素进行了优化,确定重组蛋白在IPTG终浓度为1 mmol/L、于25℃诱导6 h的条件下表达量最高。利用高浓度尿素溶解包涵体蛋白,通过Ni2+亲和层析获得了纯度大于90%的重组蛋白。将包涵体蛋白复性成为可溶蛋白,制备了人CTLA-4胞外区基因重组抗原。利用人CTLA-4胞外区基因重组抗原对5只BALB/c小鼠进行了4次免疫。选取血清效价最高的小鼠分离脾脏,提取总RNA,逆转录成cDNA。以cDNA为模板分别扩增得到大小约300bp的抗体轻、重链可变区基因片段,利用重叠延伸PCR将轻、重链可变区基因拼接成大小约为750bp的单链抗体片段ScFv。将ScFv插入噬菌体载体pCANTAB-5E中,转化至大肠杆菌TG1,经PCR鉴定ScFv插入率约为93.5%,构建了库容量约为1.4×106的鼠源噬菌体单链抗体库。经过3轮富集筛选,获得2株针对人CTLA-4胞外区基因重组抗原的鼠源单链抗体基因。另一方面,利用人CTLA-4胞外区基因重组抗原,对大容量的人源噬菌体单链抗体库按照“吸附、洗脱、扩增”的顺序反复进行了4轮淘选。第4轮淘选完成后,经ELISA鉴定,获得24株阳性噬菌体克隆。对该24株阳性噬菌体克隆携带的抗体序列进行分析,其中21株噬菌体克隆携带的抗体基因完全一致,重复率达87.5%,提示其为能够与抗原特异性结合的人源单链抗体基因。利用PCR分别扩增得到大小为324 bp的轻链可变区基因和351 bp的重链可变区基因,构建重组质粒pABL-VL和293H-VH,利用共转染293 F细胞,成功表达了具有完整结构的全抗体。经Protein A亲和层析纯化,获得了纯度大于90%的人源单克隆抗体。利用ELISA、Western印迹鉴定,结果表明抗体具有良好的特异性。此外,还制备了针对人突触小体相关蛋白25（SNAP25）的鼠源单克隆抗体。利用大肠杆菌成功表达了SNAP25蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,制备杂交瘤细胞。经过两轮筛选获得12株针对SNAP25的阳性杂交瘤细胞株,同时鉴定了抗体亚型。选取与抗原结合活性最高的14号杂交瘤细胞株制备腹水单抗,经Protein G亲和层析纯化,最终获得一株纯度大于90%的单克隆抗体,可用于肉毒毒素的检测。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 引言
•   0.1 细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）
•   0.2 单克隆抗体
•   0.3 噬菌体抗体库技术
•   0.4 突触小体相关蛋白25（SNAP25）
•   0.5 研究目的及意义
• 第1章 人CTLA-4 胞外区基因重组抗原的制备
•   1.1 前言
•   1.2 材料与试剂
•     1.2.1 菌株
•     1.2.2 主要试剂
•     1.2.3 主要溶液、培养基
•     1.2.4 主要仪器及耗材
•   1.3 实验方法
•     1.3.1 原核表达质粒的构建
•     1.3.2 重组蛋白的表达
•     1.3.3 重组蛋白表达条件的优化
•     1.3.4 重组蛋白的大量制备
•     1.3.5 重组蛋白的复性及鉴定
•   1.4 实验结果
•     1.4.1 重组表达质粒的构建
•     1.4.2 重组蛋白的表达
•     1.4.3 重组蛋白表达条件的优化
•     1.4.4 重组蛋白的纯化
•     1.4.5 重组蛋白的复性及鉴定
•   1.5 讨论
• 第2章 鼠源噬菌体单链抗体库的构建及筛选
•   2.1 前言
•   2.2 材料与试剂
•     2.2.1 动物、菌株、噬菌粒
•     2.2.2 主要试剂
•     2.2.3 主要溶液、培养基
•     2.2.4 仪器及耗材
•     2.2.5 引物合成
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 小鼠免疫
•     2.3.2 小鼠脾脏总RNA的提取及cDNA第一链的合成
•     2.3.3 单链抗体片段ScFv的制备
•     2.3.4 ScFv片段和噬菌粒载体pCANTAB-5E的酶切消化、连接
•     2.3.5 连接产物转化大肠杆菌TG1
•     2.3.6 噬菌体单链抗体库的富集筛选
•     2.3.7 噬菌体ELISA鉴定阳性克隆
•   2.4 实验结果
•     2.4.1 小鼠血清效价
•     2.4.2 脾脏总RNA的提取
•     2.4.3 单链抗体片段ScFv的制备
•     2.4.4 抗体库容量
•     2.4.5 抗体库的富集筛选
•   2.5 讨论
• 第3章 人源噬菌体抗体库的筛选及抗体制备
•   3.1 前言
•   3.2 材料与试剂
•     3.2.1 菌株、细胞
•     3.2.2 主要试剂
•     3.2.3 主要溶液、培养基
•     3.2.4 仪器及耗材
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 人源噬菌体抗体库的生物淘选
•     3.3.2 阳性噬菌体克隆的鉴定
•     3.3.3 真核表达质粒构建
•     3.3.4 细胞转染及全抗体表达
•     3.3.5 抗体的亲和纯化
•     3.3.6 抗体特异性检测
•   3.4 实验结果
•     3.4.1 阳性噬菌体克隆分析
•     3.4.2 抗体真核表达质粒的构建
•     3.4.3 抗体的表达及纯化
•     3.4.4 抗体特异性检测
•   3.5 讨论
• 第4章 人突触小体相关蛋白25单克隆抗体的制备及初步鉴定
•   4.1 前言
•   4.2 材料与试剂
•     4.2.1 动物、质粒、菌株、细胞
•     4.2.2 主要试剂
•     4.2.3 主要溶液、培养基
•     4.2.4 仪器及耗材
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 SNAP25 抗原的制备
•     4.3.2 小鼠免疫及效价检测
•     4.3.3 细胞融合
•     4.3.4 阳性杂交瘤细胞筛选
•     4.3.5 杂交瘤细胞抗体亚型分析
•     4.3.6 腹水单抗制备及纯化
•   4.4 实验结果
•     4.4.1 SNAP25 抗原的制备
•     4.4.2 小鼠血清效价
•     4.4.3 阳性杂交瘤细胞筛选
•     4.4.4 抗体亚型分析
•     4.4.5 抗体的纯化
•   4.5 讨论
• 第5章 结论与展望
•   5.1 结论
•   5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录一 溶液、培养基配制一览表
• 附录二 主要仪器与耗材一览表
• 攻读学位期间发表的学术论文及参加科研情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 孙志杰

导师: 毕秀丽

关键词: 单克隆抗体,噬菌体抗体库

来源: 辽宁大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 辽宁大学

分类号: R392-33

总页数: 101

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