YWHAB蛋白与PCV2 ORF5的互作研究及其对病毒复制的影响

论文摘要

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）属于圆环病毒科（Circoviridae）的圆环病毒属（Circovirus）成员,为单股负链闭合环状DNA病毒,基因组由17671768个核苷酸（nt）组成,病毒粒子为二十面体对称结构、无囊膜、直径约为17 nm,是已知的感染哺乳动物的最小病毒。PCV2主要感染猪,造成感染猪的免疫系统损害和抑制,引起猪圆环病毒病（Porcine circovirus disease,PCVD）,继发或混合其他病原感染,给养猪业造成严重经济损失,是目前危害养猪业最为严重的病原之一。对PCV2致病机理的阐明是更好防控其对养猪业危害的基础,病毒编码产物功能的研究是揭示PCV2致病机理的重要方面。PCV2的基因组中包含多个潜在开放阅读框（Open reading frame,ORF）,目前已有6个ORFs的编码产物被鉴定和进行了功能研究。其中,ORF5是本研究团队鉴定的PCV2的一个新的编码产物,研究发现ORF5蛋白具有引起宿主细胞周期阻滞、诱导细胞内质网应激反应和细胞自噬的作用。通过酵母双杂交技术筛选到多个与ORF5可能存在相互作用的宿主候选蛋白,14-3-3蛋白β/α（14-3-3 protein beta/alpha,YWHAB）是筛选到的受ORF5影响较为显著的蛋白之一。研究显示,宿主细胞YWHAB蛋白是一种多功能蛋白,在细胞内可以与数百种蛋白相互作用,在细胞周期调控、细胞凋亡以及细胞信号转导等细胞生物学进程中发挥重要作用。那么,宿主细胞YWHAB蛋白是否与ORF5蛋白存在相互作用?又在PCV2感染细胞中发挥什么作用?对PCV2复制有哪些影响?这些都是本研究所要解决的问题。为此,开展了YWHAB与PCV2 ORF5蛋白互作研究,YWHAB蛋白对PCV2复制的影响的研究。获得了以下结果。（1）宿主细胞YWHAB蛋白与PCV2 ORF5蛋白存在相互作用。通过免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）试验发现YWHAB蛋白与ORF5蛋白在细胞内存在相互作用,GST pull-down试验发现YWHAB蛋白与ORF5蛋白在细胞外存在相互作用,将表达YWHAB蛋白和ORF5蛋白的重组质粒转染细胞后,通过激光扫描共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope,CLSM）观察到ORF5蛋白与YWHAB蛋白存在共定位现象。（2）PCV2感染及转染ORF5表达质粒的宿主细胞中YWHAB在转录水平（mRNA）和蛋白水平均出现上调。（3）YWHAB蛋白抑制PCV2在细胞中的复制。分别构建了过表达和干扰YWHAB蛋白的细胞株,感染PCV2后用RT-qPCR和Western blot的方法检测ORF5的转录以及Cap蛋白的转录和蛋白表达水平。结果显示,YWHAB抑制ORF5和Cap基因转录,Cap蛋白的表达也显著降低。结果表明,宿主细胞YWHAB蛋白对PCV2的复制具有抑制作用。（4）YWHAB蛋白抑制了由PCV2感染诱导的细胞内质网应激、自噬以及细胞凋亡。PCV2感染YWHAB过表达和干扰细胞株,RT-qPCR及Western blot检测发现,YWHAB蛋白下调了宿主细胞内质网应激反应标志蛋白GRP78和GRP94的转录和蛋白表达,抑制内质网应激反应;YWHAB下调了细胞自噬标志蛋白Beclin1的转录和LC3Ⅱ蛋白表达水平,抑制细胞自噬作用;流式细胞仪检测发现,YWHAB能够降低细胞的ROS水平,使细胞凋亡率降低。综上所述,宿主细胞YWHAB蛋白通过与PCV2 ORF5蛋白互作,抑制了PCV2感染细胞中内质网应激反应、细胞自噬作用、降低细胞内ROS水平和细胞凋亡作用,抑制了PCV2的复制。本研究为明确PCV2 ORF5蛋白在病毒感染中的作用,为PCV2致病机理的阐明提供了新的科学资料。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 主要符号对照表
• 文献综述
•   第一章 猪圆环病毒2 型及YWHAB蛋白研究进展
•     1.1 猪圆环病毒研究进展
•       1.1.1 猪圆环病毒的分类
•       1.1.2 猪圆环病毒的基本特性
•       1.1.3 猪圆环病毒2型的进化
•       1.1.4 PCV2 感染的致病机理
•       1.1.5 PCV2 感染猪的临床表现与病理变化
•     1.2 PCV2 的各编码蛋白
•       1.2.1 ORF1 编码蛋白
•       1.2.2 ORF2 编码蛋白
•       1.2.3 ORF3 编码蛋白
•       1.2.4 ORF4 编码蛋白
•       1.2.5 ORF5 编码蛋白
•       1.2.6 ORF6 编码蛋白
•     1.3 猪圆环病毒2型与宿主细胞的相互作用
•     1.4 猪圆环病毒2型对感染细胞的影响
•       1.4.1 猪圆环病毒2 型感染与细胞内质网应激
•       1.4.2 猪圆环病毒2 型感染与细胞自噬
•       1.4.3 猪圆环病毒2 型感染与细胞调亡
•     1.5 猪圆环病毒病的诊断与防控
•       1.5.1 猪圆环病毒病的诊断
•       1.5.2 猪圆环病毒病的防控
•     1.6 YWHAB蛋白研究进展
•       1.6.1 YWHAB蛋白的分类
•       1.6.2 YWHAB蛋白的结构
•       1.6.3 YWHAB蛋白在组织中的分布及细胞定位
•       1.6.4 YWHAB蛋白的功能
•     1.7 本研究的目的及意义
• 试验研究
•   第二章 YWHAB蛋白与PCV2 ORF5 蛋白的相互作用
•     2.1 材料
•       2.1.1 细胞、病毒、菌株与质粒
•       2.1.2 主要试剂
•       2.1.3 主要仪器设备
•     2.2 方法
•       2.2.1 载体的构建与酶切鉴定
•       2.2.2 目的蛋白的鉴定
•       2.2.3 免疫共沉淀（Co-IP）试验
•       2.2.4 GST pull-down试验
•       2.2.5 ORF5 蛋白与YWHAB蛋白的亚细胞定位
•     2.3 结果
•       2.3.1 载体的构建及酶切鉴定
•       2.3.2 YWHAB表达蛋白的鉴定
•       2.3.3 重组原核质粒的诱导表达
•       2.3.4 免疫共沉淀（Co-IP）试验
•       2.3.5 GST pull-down试验
•       2.3.6 共聚焦显微镜观察YWHAB蛋白与ORF5 蛋白的细胞内定位
•     2.4 讨论
•     2.5 小结
•   第三章 YWHAB蛋白对猪圆环病毒2 型复制的影响
•     3.1 材料
•       3.1.1 病毒、细胞、质粒
•       3.1.2 主要试剂
•       3.1.3 仪器设备
•     3.2 方法
•       3.2.1 PCV2 毒株的扩增
•       3.2.2 IPMA检测PCV2 感染复数（MOI）
•       3.2.3 YWHAB过表达与shRNA慢病毒干扰载体的构建
•       3.2.4 重组慢病毒的包装
•       3.2.5 YWHAB过表达及干扰细胞株的建立
•       3.2.6 YWHAB过表达及干扰效率的鉴定
•       3.2.7 CCK-8 检测YWHAB过表达及干扰对细胞活力的影响
•       3.2.8 pEGFP-ORF5 转染和PCV2 感染对YWHAB表达的影响
•       3.2.9 过表达及干扰YWHAB对 ORF5 转录水平的影响
•       3.2.10 过表达及干扰YWHAB对 PCV2 复制的影响
•       3.2.11 数据统计分析
•     3.3 结果
•       3.3.1 shRNA慢病毒干扰载体的鉴定
•       3.3.2 YWHAB过表达及干扰细胞株的构建
•       3.3.3 YWHAB蛋白过表达及干扰细胞株中表达效果的鉴定
•       3.3.4 CCK-8 检测过表达及干扰YWHAB对细胞活力的影响
•       3.3.5 pEGFP-ORF5 转染及PCV2 感染对YWHAB表达的影响
•       3.3.6 过表达及干扰YWHAB对 ORF5 的影响
•       3.3.7 过表达及干扰YWHAB对 PCV2 复制的影响
•     3.4 讨论
•     3.5 小结
•   第四章 YWHAB蛋白对PCV2 诱导的细胞作用的影响
•     4.1 材料
•       4.1.1 细胞、病毒、菌株与质粒
•       4.1.2 主要试剂
•       4.1.3 主要仪器设备
•     4.2 方法
•       4.2.1 过表达及干扰YWHAB对 PCV2 感染诱导的ERS的影响
•       4.2.2 过表达及干扰YWHAB对 PCV2 感染诱导的细胞自噬的影响
•       4.2.3 过表达及干扰YWHAB对 PCV2 感染诱导的细胞凋亡的影响
•       4.2.4 数据统计分析
•     4.3 结果
•       4.3.1 PCV2 感染YWHAB过表达细胞株后ERS标志因子的检测
•       4.3.2 PCV2 感染YWHAB干扰细胞株后ERS标志因子的检测
•       4.3.3 PCV2 感染YWHAB过表达及干扰细胞株后细胞自噬标志因子的检测
•       4.3.4 YWHAB蛋白对PCV2 感染诱导的细胞凋亡的影响
•     4.4 讨论
•     4.5 小结
•   结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 侯玉凤

导师: 郭抗抗

关键词: 猪圆环病毒型,蛋白,蛋白互作,病毒复制

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 西北农林科技大学

基金: 国家自然科学基金项目(编号:31672580)

分类号: S852.651

总页数: 106

文件大小: 5182K

下载量: 128