AMPK磷酸化MCU对有丝分裂能量稳态的调控研究

论文摘要

细胞是生命体的基本单元,具有复杂的内部结构,为了维持细胞正常的生长和增殖,细胞内各项生理活动需要有序的进行,这就需要细胞对内环境的稳态进行精确的调节。特别是在一些重要的生命过程,例如DNA复制、细胞分裂等过程中,及时调整细胞整体的结构类型、代谢特点和能量状态,对细胞的生存和健康尤为重要。据报导,细胞内存在一些物质和能量的感受器与调节器,能够针对细胞的生理特点和内外环境对细胞的生理活动进行调节。例如,mTOR可感受细胞内氨基酸状态,在氨基酸不足的情况下可以通过调节物质代谢维持细胞内氨基酸水平稳定。但是,在一些高耗能的生理活动发生时,细胞如何协调细胞能量代谢从而维持细胞整体能量稳态,尚未研究清楚。已知线粒体是细胞的能量工厂,通过线粒体有氧呼吸产生的腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)是细胞主要的能量来源。因此,调节线粒体的氧化磷酸化强度对于维持细胞整体的能量稳态有重要意义。钙离子是细胞内广泛存在的第二信使,已报导钙离子可以通过线粒体钙单向转运体(MCU)进入线粒体,从而调节线粒体的产能状态。在前期研究中,我们发现细胞进入有丝分裂期后,细胞ATP水平会发生一定的下调,同时伴随着细胞内钙离子会发生快速大量进入线粒体的现象,称为线粒体钙闪(mitochondrial calcium transient),从而激发线粒体氧化呼吸,促进ATP产生以满足细胞对于能量的需要。但是,在此过程中细胞是如何感知能量不足状态,并且做出快速精准的调节,仍有待研究。通过对线粒体钙转运体MCU的序列进行分析,我们发现MCU的57位丝氨酸(Ser)结构域符合AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)的磷酸化底物特点。我们通过体外激酶实验和点突变实验进行验证,鉴定出AMPK是MCU的上游激酶,在体外可促进MCU的57位丝氨酸的磷酸化。通过钙流实验,我们发现MCU 57位磷酸化可以提高MCU活性,将更多的钙离子摄入线粒体,从而提高线粒体的氧化呼吸强度,激发ATP生成。在使用57位丝氨酸磷酸化MCU抗体对细胞进行免疫荧光染色时,我们发现处于有丝分裂期的细胞荧光强度明显高于间期细胞,这提示我们有丝分裂期细胞具有更高的MCU磷酸化水平,这有助于细胞保持较高的线粒体呼吸强度,为有丝分裂提供足够的能量。通过进一步研究,我们发现MCU 57位磷酸化对MCU在线粒体上的定位、MCU多聚化状态并没有明显影响,提示磷酸化的功能主要是提高MCU的钙离子通道活性。综上所述,我们发现了在有丝分裂中AMPK可通过磷酸化MCU促进钙离子大量进入线粒体,激发ATP产生以改变细胞能量不足的状态,从而阐释了一条细胞精确感知自身能量状态,并通过调节钙离子活动从而快速准确调节细胞能量稳态的新路径。细胞分裂是生物生长发育的基础,通过供给足够的ATP以维持有丝分裂的正确进行,无论对于细胞还是个体都是至关重要的。此外,细胞一些其他的生理过程发生时,以及细胞外剧烈刺激例如病毒感染、病原入侵等条件下细胞都可能处于能量不足状态并产生应激动员。我们的发现,深入揭示了细胞响应剧烈能量不足状况,并加以快速调节的机制,有助于深刻理解细胞能量平衡的维持和自我调节。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 实验材料和方法
•   1.实验材料
•     1.1 细胞系
•     1.2 菌株与质粒
•     1.3 主要试剂
•       1.3.1 克隆相关试剂
•       1.3.2 蛋白免疫印记实验和免疫荧光实验相关试剂
•       1.3.3 细胞培养所用试剂
•       1.3.4 抗体
•       1.3.5 细胞周期实验所用试剂
•       1.3.6 蛋白纯化相关耗材及试剂
•       1.3.7 主要试剂配方
•     1.4 实验所用仪器
•   2. 实验方法
•     2.1 分子克隆（以构建p GEX-4T1-MCU NTD质粒为例）
•     2.2 HeLa细胞有丝分裂周期实验
•     2.3 细胞周期中ATP水平动态监测
•     2.4 细胞周期中线粒体钙闪动态监测
•     2.5 293TN外源共表达实验
•     2.6 免疫印记杂交
•     2.7 考马斯亮蓝染色
•     2.8 GST蛋白纯化
•     2.9 HeLa细胞药物处理
•     2.10 通过免疫共沉淀获得AMPK激酶活性三聚体
•     2.11 体外激酶实验
•     2.12 细胞免疫荧光实验
•     2.13 高效液相色谱分子筛实验
• 第二章 实验结果
•   1. 细胞内ATP不足导致有丝分裂进程发生阻滞
•   2. 外源ATP加入可以缓解因干涉MCU导致的有丝分裂周期进程阻滞
•   3. MCU介导的线粒体钙闪为有丝分裂提供能量
•   4. 进入有丝分裂期后细胞内ATP浓度呈现先下降后上升的趋势
•   5. 线粒体钙闪的发生受到细胞内ATP/AMP相对浓度的调节
•   6. MCU蛋白57位氨基酸符合AMPK的底物磷酸化位点特征
•   7. AMPK可在体外反应中磷酸化MCU 57 位丝氨酸
•   8. AMPK-MCU磷酸化的发生对线粒体不同p H范围无明显倾向性
•   9. 在细胞内过表达AMPK质粒可促进MCU磷酸化的发生
•   10. AMPK激活剂处理细胞可提高MCU磷酸化水平
•   11. 免疫荧光实验证明有丝分裂中期细胞具有更高的MCU磷酸化水平
•   12. Western Blot实验证明有丝分裂中期细胞具有更高的MCU磷酸化水平
•   13. MCU57位磷酸化不改变蛋白多聚状态
•   14.57 位磷酸化对MCU分子的线粒体定位无影响
• 第三章 结论与展望
•   结论
•   讨论
• 参考文献
• 作者在学期间取得的学术成果
• 主要简历
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王恺

导师: 夏晴,潘欣

关键词: 线粒体钙闪,磷酸化,能量状态

来源: 军事科学院

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 军事科学院

分类号: Q253

总页数: 56

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