谷氨酸氧化酶突变体、双酶共表达载体及其应用论文和设计-刘君

全文摘要

本发明公开了一种通过对L‑谷氨酸氧化酶进行定点突变，获得一种酶活明显提高的谷氨酸氧化酶突变体，共表达该突变体酶和过氧化氢酶构建重组工程菌株，以L‑谷氨酸盐为底物，在常温常压条件下制备α‑酮戊二酸。本发明所采用的工艺简单，具有高转化率、易分离纯化、生产条件温和、环境污染小等特点，具有较好的工业化应用前景。

主设计要求

1.一种谷氨酸氧化酶突变体，其特征在于，所述谷氨酸氧化酶突变体的氨基酸序列选自如下的组：a)对应于SEQIDNO:1第280位氨基酸由丝氨酸S突变为苏氨酸T的氨基酸序列，或者b)对应于SEQIDNO:1第280位氨基酸由丝氨酸S突变为苏氨酸T的氨基酸序列，并且在对应于SEQIDNO:1的第533位氨基酸由组氨酸H突变为亮氨酸L的氨基酸序列。

设计方案

1.一种谷氨酸氧化酶突变体，其特征在于，所述谷氨酸氧化酶突变体的氨基酸序列选自如下的组：

a) 对应于SEQ ID NO:1第280位氨基酸由丝氨酸S突变为苏氨酸T的氨基酸序列，或者

b) 对应于SEQ ID NO:1第280位氨基酸由丝氨酸S突变为苏氨酸T的氨基酸序列，并且在对应于SEQ ID NO:1的第533位氨基酸由组氨酸H突变为亮氨酸L的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的谷氨酸氧化酶突变体的编码基因，其特征在于，所述a）组氨基酸序列的编码基因是SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的谷氨酸氧化酶突变体的编码基因，其特征在于，所述b）组氨基酸序列的编码基因是SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。

4.一种重组菌株，是将含有权利要求1所述突变体的编码基因或权利要求2或3所述编码基因的载体导入宿主菌株所得到。

5.权利要求1所述的谷氨酸氧化酶突变体、权利要求2或3所述的编码基因或者权利要求4所述的重组菌株在α-酮戊二酸生产中的应用。

6.一种双酶共表达载体，所述共表达载体是在一个质粒中同时包含权利要求1所述的谷氨酸氧化酶突变体的编码基因和过氧化氢酶的编码基因。

7.根据权利要求6所述的双酶共表达载体，所述谷氨酸氧化酶突变体的编码基因是如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。

8.根据权利要求6或7所述的双酶共表达载体，所述双酶共表达载体中过氧化氢酶的编码基因含有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

9.根据权利要求6或7所述的双酶共表达载体，所述双酶共表达载体采用单启动子模式将启动子和所述谷氨酸氧化酶突变体的编码基因、过氧化氢酶的编码基因进行串联表达；或者采用双启动子模式，在谷氨酸氧化酶突变体的编码基因和过氧化氢酶的编码基因前分别添加启动子。

10.根据权利要求9所述的双酶共表达载体，所述启动子为tac强启动子或者trc强启动子。

11.一种双酶共表达重组菌株，含有如权利要求6-10任一项所述的双酶共表达载体。

12.根据权利要求11所述的双酶共表达重组菌株，所述重组菌株是将所述双酶共表达载体导入宿主菌株，所述宿主菌株选自谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum<\/i>）、大肠杆菌（Escherichia coli<\/i>）或枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis<\/i>）。

13.权利要求6-10任一项所述的双酶共表达载体在制备α-酮戊二酸中的应用。

14.权利要求11-12任一项所述的双酶共表达重组菌株在制备α-酮戊二酸中的应用。

15.一种制备α-酮戊二酸的方法，包括培养权利要求11或12所述的双酶共表达重组菌株。

16.根据权利要求15所述的制备α-酮戊二酸的方法，所述方法包括以谷氨酸盐为底物，采用所述双酶共表达重组菌株进行全细胞催化制备α-酮戊二酸。

设计说明书

技术领域

本发明涉及一种谷氨酸氧化酶突变体、双酶共表达载体及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

α-酮戊二酸（α-KG）是一种重要的有机酸，在有机体细胞代谢中发挥着重要作用，也是合成多种糖类、氨基酸以及蛋白质等的重要前体物质，在食品、医药、饲料、化工和化妆品等行业中具有广阔的应用前景。近年来，α-KG广泛应用于运动营养饮料和保健品，α-KG经人体消化吸收后，体内过多的氨可以结合到α-KG上以减少氨中毒带来的问题，同时参与体内氮代谢等代谢过程。此外，α-KG也可作为体格增强剂，与鸟氨酸结合后，能提高生长激素、胰岛素的水平，而且可抑制肌纤维的分解、在减少蛋白质消耗的前提下起到修复肌肉损伤的作用, 具有较高的保健价值。

目前，α-KG的生产方法包括化学合成法、微生物发酵法和生物催化法。传统α-KG生产采用化学合成法，但化学合成工艺中所使用的强酸强碱、氰化物等有害试剂，不仅容易引起环境污染，更限制了其在食品、化妆品和医药等行业的应用。微生物发酵法发酵周期长，且发酵产物中丙酮酸、富马酸等副产物较多，会增加后续α-KG提取的难度和费用，尚未实现工业大规模生产。酶法生产α-KG具有反应周期短、转化率高等优势，牛盼清等通过诱变获得高产谷氨酸氧化酶的链霉菌突变株，在最优条件下转化24 h，α-KG产量可达38.1 g\/L（牛盼清, 等. 生物工程学报, 2014, 8: 1318-22）；利用基因工程的方法，将谷氨酸氧化酶基因在大肠杆菌中异源表达，通过酶法催化，24 h生成α-KG产量104.7 g\/L（Niu PQ, et al. JBiotechnol, 2014, 179:56-62）。利用纯化酶进行体外催化不仅需要经过繁琐的蛋白纯化步骤，而且反应过程中需外源添加大量昂贵的过氧化氢酶辅助催化，大大增加了工业成本。相比分离酶进行体外催化，全细胞生物催化剂更容易制备，催化性能更加稳定，不易受外界温度、pH等因素的影响；转化过程中不需外源添加辅助因子，且无有毒有害产物的生成，环境友好，具有工业化应用前景。

谷氨酸氧化酶 (L-glutamate oxidase, LGOX) 是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸为辅基的黄素蛋白酶类，具有高度的底物立体异构选择性，催化效率高，反应条件温和，能在不添加外源性辅助因子的条件下氧化L-谷氨酸生成过氧化氢、氨和α-酮戊二酸。研究发现，该酶主要存在于链霉菌中，但产酶能力相差较大。发掘和鉴定具有高活性或底物特异性的谷氨酸氧化酶，并获得符合生理研究和生产应用要求的酶催化体系，将为工业生产α-KG提供有利条件。

发明内容

本发明的目的在于利用基因工程手段对微生物来源的L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶进行共表达优化，构建出了催化性能优良的共表达重组菌株，并使用该菌株建立了高效生产α-KG的全细胞转化方法，如图1所示。

本发明的一个目的在于提供一种酶活提高的谷氨酸氧化酶突变体，是将对应于SEQ ID NO:1的第280位氨基酸由丝氨酸S突变为苏氨酸T的氨基酸序列；或者所述谷氨酸氧化酶突变体是进一步包括在对应于SEQ ID NO:1的第533位氨基酸由组氨酸H突变为亮氨酸L的双位点突变的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述谷氨酸氧化酶突变体包括如SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列，所述谷氨酸氧化酶突变体的编码核苷酸序列可以是SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；在另一个实施方案中，所述谷氨酸氧化酶突变体包括如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述谷氨酸氧化酶突变体的编码核苷酸序列可以是SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。本发明所述谷氨酸氧化酶突变体编码核苷酸序列可以是来源于SEQ ID NO:2所示的野生型的L-谷氨酸氧化酶编码核苷酸序列，例如所述突变体的编码核苷酸序列可以是SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经突变或特定位点的核苷酸被取代而得到。

在一个实施方案中，所述野生型L-谷氨酸氧化酶来源于茂源链霉菌（Streptomyces mobaraensis<\/i>）。

在一个实施方案中，所述谷氨酸氧化酶突变体的氨基酸序列还可以包括1-10个其他氨基酸残基的取代、缺失或插入，但仍然保持L-谷氨酸氧化酶活性。

本发明还提供表达上述谷氨酸氧化酶突变体的重组菌株，是将所述突变体的编码核苷酸序列或含有所述编码核苷酸序列的载体导入宿主菌株所得到。所述重组菌株可用于生产α-酮戊二酸。

本发明的第二个目的在于提供一种生产α-KG的双酶共表达载体，所述共表达载体是在一个质粒中同时导入L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的编码基因。

根据本发明，所述L-谷氨酸氧化酶来源于链霉菌属，所述过氧化氢酶来源于肠杆菌属。根据本发明，所述用于双酶共表达的载体种类没有特殊限定，可以为能够在菌株中表达目的基因的本领域常用的各种表达载体，例如大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭表达质粒pXMJ19，或pDXW系列载体，或pBL1系列载体，或大肠杆菌表达质粒pET系列载体, 或pBAD系列载体，或枯草芽孢杆菌表达质粒pHT01，或pMA5载体等，在优选的实施方式中所述表达载体为pXMJ19质粒。在一个实施方案中，所述L-谷氨酸氧化酶含有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。在另一个实施方案中，所述L-谷氨酸氧化酶是如第一目的所述的谷氨酸氧化酶突变体，所述突变体的氨基酸如SEQ ID NO:5或SEQID NO:7所示，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示。

在一个实施方案中，所述双酶共表达载体中过氧化氢酶含有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明提供了多种单质粒双酶共表达体系，在一个质粒中同时表达L-谷氨酸氧化酶的编码基因和过氧化氢酶的编码基因。在一个实施方案中，所述双酶共表达载体是采用单启动子模式将一个启动子和所述L-谷氨酸氧化酶的编码基因以及过氧化氢的编码基因进行串联表达，所述两种编码基因可以任意顺序串联；在另一个实施方案中，所述双酶共表达载体是采用双启动子模式，分别在L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的编码基因前分别添加启动子。所述启动子可以为tac强启动子或者trc强启动子。在一个实施方案中，优选单启动子模式，且启动子为tac强启动子。

在本发明的实施方案中，在单启动子模式中，两个编码基因之间可以增加保守型RBS相关序列进行分割；或者在双启动子模式中，启动子和编码基因之间分别增加RBS相关序列。

在一个具体实施方案中，采用单个tac强启动子将L-谷氨酸氧化酶编码基因和过氧化氢编码基因进行串联表达，其中L-谷氨酸氧化酶编码基因和过氧化氢酶编码基因间由保守性RBS相关序列所分割；在另一个具体实施方案中，采用双启动子模式分别在L-谷氨酸氧化酶编码基因和过氧化氢酶编码基因前添加tac强启动子和保守性RBS相关序列；在又一个具体实施方案中，采用双启动子模式在L-谷氨酸氧化酶编码基因前添加tac强启动子和保守性RBS相关序列，在过氧化氢酶基因前添加trc强启动子和保守性RBS相关序列。

本发明用于共表达体系构建的启动子和RBS相关序列为：设计图

谷氨酸氧化酶突变体、双酶共表达载体及其应用论文和设计-刘君

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主设计要求

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