一、猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因和流感病毒HA基因的联合表达及应用（论文文献综述）
曹增国[1]（2021）在《SARS-CoV-2编码蛋白抑制宿主Ⅰ型干扰素应答机制研究》文中研究说明新型冠状病毒病（Coronavirus disease 2019,COVID-19）,又称新型冠状病毒肺炎,是由新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）感染引起的、以肺炎为主要临床症状的、严重威胁人类健康及公共卫生安全的重要人兽共患传染病。时至今日,其感染人数和流行区域的空间范围已遍及全球,并演变为全球大流行。SARS-CoV-2在病毒分类学上属于冠状病毒科β冠状病毒属,该属病毒还包括在2002年出现的严重急性呼吸系统综合征冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV）和在2012年出现的中东呼吸系统综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV）,此三种病毒均可感染多种动物以及人类,并引起致死性呼吸系统疾病,这也使得冠状病毒成为21世纪严重影响全人类公共健康发展的主要阻力之一。此外,亦有4种地方流行性冠状病毒（分别为OC43、229E、NL63和HKU1）可感染人类,引起感冒等呼吸道疾病。SARS-CoV-2基因组为单股正链RNA,长约29.9 kb,被包装于直径约80 nm的病毒内腔中,可编码16个非结构蛋白（NSP1-16）、4个结构蛋白（S、E、M和N）以及若干个辅助蛋白（如ORF3a、ORF3b、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8及ORF10等）。在SARS-CoV-2的生命周期中,非结构蛋白构成病毒复制酶参与病毒复制及RNA合成;结构蛋白负责形成病毒粒子并参与病毒感染;辅助蛋白与病毒毒力及致病机制密切相关,并参与调控病毒感染和免疫应答。作为宿主天然免疫的重要组成部分,干扰素应答参与构成了宿主机体抗病原微生物（如病毒）感染的第一道防线。干扰素是一类具有强大功能的细胞因子,可通过控制炎症反应、协调免疫应答直接诱导机体的抗病原微生物免疫应答,从而抵抗外来病原的入侵和感染。病毒感染诱导产生的干扰素可经由不同的信号转导途径,最终导致数百种干扰素刺激基因（IFN-stimulated genes,ISGs）的转录和表达,并进一步发挥抗病毒感染的作用。为阐明SARS-CoV-2编码蛋白在宿主I型干扰素应答（包括I型干扰素的产生及I型干扰素的信号转导）中的作用,并解析其作用的分子机制,本研究分别将SARS-CoV-2编码蛋白克隆至真核表达载体,转染HEK293T细胞,以体外表达病毒编码蛋白。随后逐一检测SARS-CoV-2各编码蛋白对宿主I型干扰素产生及信号转导通路的影响。随后,以对宿主I型干扰素应答具有抑制作用的SARS-CoV-2编码蛋白为研究对象,从“病毒-宿主”相互作用的角度,简单解析了其发挥抑制作用的分子机制。结果如下:（1）在I型干扰素产生通路中,3个非结构蛋白（NSP1、NSP6和NSP13）和1个辅助蛋白（ORF6）具有显着的抑制作用。其中,NSP6通过结合TANK结合激酶1（TANK binding kinase 1,TBK1）而下调干扰素调节因子3（Interferon Regulatory Factor 3,IRF3）的磷酸化水平,最终抑制IFN-β的产生通路,但NSP6与TBK1的结合并不会影响TBK1的磷酸化;NSP13通过结合TBK1并下调其磷酸化的方式,抑制IRF3的磷酸化激活,进而导致IFN-β的产生通路受到抑制;ORF6通过结合核转运受体蛋白KPNA2而抑制IRF3的入核转运,最终导致IFN-β的产生通路受到抑制。（2）在I型干扰素信号转导通路中,NSP1、NSP6、NSP7、NSP13、NSP14、ORF3a、M、ORF6、ORF7a、ORF7b均可显着抑制I型干扰素的信号转导通路。其中,NSP1、NSP6、NSP13、ORF3a、M及ORF7b通过下调信号转导和转录激活因子1（Signal transducer and activator of transcription proteins 1,STAT1）的磷酸化以抑制I型干扰素的信号转导通路;NSP6、NSP13、ORF7a及ORF7b通过下调STAT2磷酸化以抑制I型干扰素的信号转导通路;ORF6通过结合核转运受体蛋白KPNA2以限制STAT1的入核,并最终导致I型干扰素信号转导通路受到抑制。泛素作为重要的宿主因子,参与先天免疫的调节。而蛋白质泛素化是一种蛋白质翻译后修饰方式,在许多生物学过程中发挥着重要作用。以上述具有抑制宿主I型干扰素应答功能的SARS-CoV-2编码蛋白作为研究对象,研究泛素化在其抑制宿主I型干扰素应答中的作用。结果发现:NSP13、ORF3a和ORF7a均存在泛素化修饰。通过对ORF7a泛素化修饰特性分析可得,SARS-CoV-2 ORF7a主要在第119位赖氨酸残基处发生K63多聚泛素化修饰。随后经过点突变,以丙氨酸（Alanine,A）替代第119位赖氨酸（Lysine,K）,构建ORF7a泛素化缺陷型突变（ORF7a-K119A）。并比较其与野生型ORF7a（ORF7a-WT）在抑制I型干扰素信号转导方面的差异,最终证明SARS-CoV-2 ORF7a通过泛素化修饰增强其抑制STAT2磷酸化的能力,从而加强其对宿主I型干扰素信号转导通路的抑制作用。基于SARS-CoV-2反向遗传学系统,通过分子生物学手段将海肾荧光素酶（Renilla luciferase,Rluc）基因插入并替换SARS-CoV-2（毒株2019-n CoV/USAWA1/2020）全基因组第21,563-28,259位核苷酸（包括结构蛋白基因S、M、E及辅助蛋白基因ORF3a、ORF3b、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8）,成功构建了SARS-CoV-2复制子系统。随后使用可有效抑制SARS-CoV-2复制的药物瑞德西韦（Remdesivir）验证了该复制子系统的实用性,结果证明该复制子系统可以作为一种有效的工具,在抗病毒药物筛选及评价不同环境下病毒复制能力中的实用性。最后本研究将该复制子系统应用于比较三种高致病性冠状病毒（SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV）NSP1和NSP6抑制宿主I型干扰素信号转导活性对病毒复制效率的影响中,证明了SARS-CoV-2非结构蛋白NSP1、NSP6在抑制宿主I型干扰素信号转导中具有较高的活性,而这可能最终导致了SARS-CoV-2具有比SARS-CoV和MERS-CoV更强的复制能力。综上所述,本研究筛查了SARS-CoV-2对宿主I型干扰素应答具有抑制作用的蛋白,并从“病毒-宿主”相互作用的角度,分别解析了各个病毒蛋白在I型干扰素产生和信号转导中发挥抑制作用的分子机制,为冠状病毒疫苗研发及抗病毒药物筛选提供了理论依据。此外,本研究还建立了携带海肾荧光素酶报告基因的复制子系统,降低了相关研究的安全等级,有利于相关研究在普通实验室的开展。
丁耀忠[2]（2021）在《QH-08PRRS分离株Caspase-8介导的凋亡途径及实时定量PCR方法的建立》文中研究表明猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）的病原,猪是其唯一宿主。PRRSV属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属,不分节段的一种有囊膜的单股正链RNA病毒,根据抗原特性和基因组特征分为两个基因型:欧洲型（European,Eu）,即1型PRRSV;北美型（North American,NA）,即2型PRRSV。该病毒的基因组长度约为15 kb,具有九个或十个重叠的开放阅读框（ORF）:ORF 1a-1b,ORF 2-7（病毒结构蛋白GP2,E,GP3,GP4,ORF5a,ORF5,M和N）。与马动脉炎病毒（equine arteritis virus,EAV）,乳酸脱氢酶升高病毒（lactate dehydrogenase-elevating virus,LDV）和猴出血热病毒（simian hemorrhagic fever virus）为同一属病毒。我们分离了一株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV）,将其命名为QH-08（Gen Bank:KU201579）。对其进行溯源后发现,其与HUN4和JXA1的进化变异几乎没有差异,全序列同源性分别为97.2%和97%,同时与HP/Thailand19500LL/2010（泰国,KF735060）、PRRSV/MZ/IND/1A/18（印度,MK287894）和BH58/10（老挝,JN626287）的全序列同源性为95.7%、93.8%和95.9%;遗传进化表明,这5株2型PRRSV分离株处在同一个进化分支上,而且QH-08分离株在进化谱系上与HUN4分离株具有更高的亲源性;同时在分子水平上比较34株分离株的同源性后得到了一种假想,即PRRSV-2型ORF1α1b的同源性差异是导致PRRS疫苗对于同源毒株攻毒保护力差异的重要原因,从而为疫苗选择和实时real-time RT-PCR的建立提供分子理论基础。对于天然抗病毒通路,如TLR 3凋亡途径,能否被有关刺激因子激活从而抑制PRRSV的感染能力;另外,选择一种可以防控QH-08 PRRSV的感染的疫苗对于将来促进PRRSV的防控可以提供一种参考依据;同时,由于PRRSV-2存在大量重组现象,建立能够覆盖经典毒株和变异毒株的、特异性检测PRRSV-2型的实时定量PCR技术,对于PRRSV-2型的防控具有积极意义。因此,在基于对不同的PRRSV-2型分子分析的基础上,进行了一些系列的研究。首先,通过病毒噬斑、qPCR和IFA等检测方法评估了刺激因子—盐酸吗啉胍对QH-08在Marc-145细胞上的复制有一定的抑制作用,其抑制机理是盐酸吗啉胍诱导在细胞水平上诱导TLR 3依赖的凋亡途径,进一步激活了caspas-8和caspas-3凋亡途径进而抑制了PRRSV复制,而且,这种抑制作用与caspase-3激活后Mcl-1表达量下调有关。这种通过激活caspase-8和caspase-3天然抗病毒信号通路或负调控Mcl-1表达来发挥其抗PRRSV的复制的机制,能够为天然抗病毒途径的研发提供启发作用。其次,选用了四种疫苗,分别为Ingelvac PRRS MLV、CH-1a、JXA1和JXA1-RMLV疫苗,其疫苗毒株的特性为ORF1α1b序列同源性为25.3-96.3%,而ORF2-ORF7同源性为85.8-99.6%。其中,第1组和第4组（n=5）的仔猪分别使用上述四种疫苗按照一一对应的方式分别进行免疫,第5组和第6组（n=3）仅仅注射PBS作为阳性和阴性对照。免疫28 d后,除阴性对照组外,第1组-第5组分别使用等量QH-08 PRRSV进行攻毒;与攻毒后14 d,将所有仔猪处死后进行尸检。研究表明,与第5组猪（阳性对照）相比,接种疫苗的猪的体温、肺损伤程度、血清和肺组织中的病毒含量水平显着降低（p<0.05）;在攻毒期内,JXA1和JXA1-R MLV疫苗对QH-08 PRRSV攻击提供了100%的保护,保护率显着的高于Ingelvac PRRS MLV和CH-1a疫苗的保护率。最后,基于QH-08分离株与其余毒株序列特性建立了一种检测2型PRRSV的实时定量PCR技术,研究表明,其检测最低核酸检测限为10拷贝/μL,敏感性是多重RT-PCR的10倍;特异性良好,不与1型PRRSV、PCV2、PRV和CSF发生交叉反应性。对临床样品的阳性检出率和阴性检出率均为100%;研制的3批试剂盒在一定保存期内,其重复性、特异性和敏感性良好,可以满足2型PRRSV的临床检测和防控的需求。
蓝俊虹[3]（2021）在《α-单月桂酸甘油酯对猪繁殖与呼吸综合征病毒抑制机制的探究》文中指出猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的一种急性传染病。目前PRRS防控主要是通过疫苗,但是疫苗防护效果并不理想,所以寻找新的PRRS防控方法十分必要。本研究旨在探究α-单月桂酸甘油酯（α-Glycerol monolaurate,α-GML）对PRRSV的抑制效果以及其作用机制。本研究主要分为两个试验。试验一,研究不同的α-GML处理方式对PRRSV的抑制效果。（1）通过电镜观察、RT-PCR及Western blot确定所得病毒是PRRSV病毒,并采用Reed-Muench法测定病毒效价（TCID50）在10-5.25/0.1m L。（2）通过MTT法筛选出α-GML的最大无细胞毒性浓度为25μg/m L。（3）设置空白对照组、α-GML对照组、PRRSV组,α-GML+PRRSV组,采用α-GML后处理与共处理2种方式进行处理,利用RT-q PCR、Western blot以及间接免疫荧光法对PRRSV核衣壳蛋白N的表达量进行测定,结果显示,α-GML后处理对PRRSV核衣壳蛋白N的基因与蛋白表达均无明显抑制的作用（P>0.05）,而α-GML与PRRSV共处理可显着降低核衣壳蛋白N的基因与蛋白表达量（P<0.01）。表明α-GML与PRRSV共处理具有抑制PRRSV的作用。试验二,依据试验一的结果,探究α-GML抑制PRRSV的机制。（1）α-GML共处理对病毒活力的影响。试验分为空白对照组、PRRSV组和α-GML+PRRSV组,采用Reed-Muench测定样品的病毒效价,并采用ELISA测定样品的病毒量,结果显示α-GML与PRRSV共处理极显着降低病毒效价（P<0.001）,并明显减少病毒量（P<0.001）,表明α-GML处理能明显降低病毒活力,甚至具有直接杀灭病毒的作用。（2）α-GML对病毒囊膜结构及细胞受体的影响。试验分为空白对照组、α-GML对照组、PRRSV组以及α-GML+PRRSV组,结果显示α-GML与PRRSV共处理,可显着降低PRRSV囊膜蛋白M以及GP5的基因表达量（P<0.01）,并显着下调了细胞表面受体CD163的基因相对表达量（P<0.05）,表明α-GML具有影响PRRSV囊膜以及受体表达的作用。（3）α-GML对免疫相关细胞信号通路的调节作用。试验分为空白对照组、α-GML对照组、PRRSV组以及α-GML+PRRSV组,测定TLR7/8-Myd88-NF-κB/IFNα信号通路上关键因子的基因与蛋白表达,结果表明,与PRRSV组相比,α-GML与PRRSV共处理可显着下调TLR7、TLR8、TRAF6、TRAF3以及NF-κB1（p50）的基因表达（P<0.05）,显着上调NF-κB抑制酶亚基IκKβ的基因表达（P<0.05）,并下调Myd88与NF-κB1（p50）的蛋白表达量,显着上调NF-κB通路抑制酶IκB的蛋白表达量（P<0.05）,同时显着减少促炎因子TNF-α的分泌（P<0.05）,表明α-GML处理抑制了由PRRSV感染引起的NF-κB通路的激活,一定程度上缓解相关炎症反应。综上所述,α-GML与PRRSV共处理具有抑制PRRSV的作用。α-GML抑制PRRSV的机制主要可能是α-GML降低PRRSV的病毒活力,降低PRRSV囊膜蛋白M与GP5以及细胞受体CD163的表达,同时抑制PRRSV引起的NF-κB通路的激活,并减少TNF-α的分泌。
张玉娇[4]（2021）在《膜蛋白PCSK9和BST2抑制PRRSV复制的机制研究》文中进行了进一步梳理猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS）自1987年爆发以来,严重危害着养猪业的发展,尤其是2006年爆发的高致病性PRRS（Highly Pathogenic-PRRS,HP-PRRS）,对我国养猪业造成了巨大的经济损失。HP-PRRSV具有高发病率、高死亡率的特点,发病率可达50%-100%,死亡率可达20%-100%（TONG et al.,2007）。为了探寻HP-PRRSV毒株Hu N4与其传代致弱的Hu N4-F112疫苗株致病力差异的机制,本实验室前期通过用流式细胞术分析这两种病毒感染PAM细胞的效率,发现Hu N4感染PAM的效率显着高于Hu N4-F112。进而利用流式细胞术成功分离感染Hu N4或Hu N4-F112的PAM细胞,分别抽提这些PAM的细胞膜,利用Shotgun质谱技术初步筛选出PRRSV强弱毒感染细胞的差异表达膜蛋白,并验证其对PRRSV复制的影响。本论文选择差异表达的膜蛋白-前蛋白转化酶枯草溶菌素9（Proprotein Convertase Subtilisin Kexin 9,PCSK9）和骨髓基质细胞抗原2（Bone Marrow Stromal Cell Antigen 2,BST2）进行深入研究,探究差异表达的膜蛋白对PRRSV复制的影响。PCSK9又称为调节神经凋亡的转化酶（Neural Apoptosis Regulated Convertase 1,NARC-1）,属于前蛋白转化酶（Proprotein Convertases,PC）家族,在胆固醇运输过程中具有重要的作用,而对PCSK9在抗病毒过程中的研究相对较少。已有文献表明,PCSK9能够促进HCV受体LDLR的降解,从而抑制HCV复制。本人前期研究发现,PCSK9能够明显抑制Hu N4、Hu N4-F112的复制,且对Hu N4的抑制作用明显强于Hu N4-F112。本研究对PCSK9的抗病毒机制做了进一步研究,利用Western blot、RT-q PCR、TCID50测定、免疫共沉淀、激光共聚焦等技术,发现PCSK9的C端结构域具有抗病毒作用,PCSK9能够与PRRSV细胞受体CD163互作,PCSK9主要通过溶酶体途径降解PRRSV受体CD163,且K48/K63位泛素化修饰为其主要修饰方式。利用制备的PCSK9单克隆抗体,进一步检测内源性PCSK9的表达情况,实验结果表明:在PRRSV感染早期,宿主细胞上调PCSK9表达,而当病毒量达到一定程度时,PRRSV能够抑制内源性PCSK9表达,拮抗PCSK9的抗病毒作用。进一步研究表明,PRRSV Nsp11能够抑制PCSK9表达,突变PRRSV Nsp11的核酸内切酶活性位点后,Nsp11不再抑制PCSK9的表达,突变Nsp11的去泛素化酶活性对PCSK9的抑制作用没有影响,PRRSV Nsp11拮抗PCSK9的抗病毒作用与其核酸内切酶活性相关。BST2,又称为Tetherin,CD317,HM1.24,为干扰素诱导的II型跨膜蛋白。BST2能够利用其特殊的蛋白拓扑结构将囊膜病毒粒子裹挟到宿主细胞膜上,从而抑制病毒的释放过程。在本研究中,通过体外过表达以及si RNA干扰实验发现,过表达BST2能够抑制PRRSV复制,敲低BST2能够促进PRRSV复制。BST2的抗病毒能力与病毒感染剂量间存在重要关系,当感染剂量较小时,BST2能够明显抑制PRRSV复制;当感染剂量较大时,PRRSV能够抑制BST2表达,从而拮抗BST2的抗病毒作用。进一步研究表明,BST2能通过抑制PRRSV E蛋白m RNA的表达,也能够通过泛素蛋白酶体途径抑制Nsp12的表达等不同方式抑制PRRSV复制;低剂量接毒能够上调BST2表达,发挥宿主抗病毒作用;高剂量接毒能够下调BST2表达,从而拮抗BST2的抗病毒作用。进一步研究表明PRRSV Nsp11抑制BST2表达与其核酸内切酶活性相关,PRRSV Nsp5能够与BST2互作、共定位,抑制细胞质和细胞膜中BST2的表达,在拮抗BST2的抗病毒过程中具有重要作用。另外,本研究成功制备了猪源PCSK9单克隆抗体,利用单克隆抗体分选不同丰度膜蛋白的PAM细胞,进而感染PRRSV强弱毒,为后期探究膜蛋白丰度与PRRSV感染间关系提供了工具支持。综上所述,本研究对前期筛选到的影响PRRSV强弱毒复制的差异膜蛋白进行回复验证,验证差异膜蛋白PCSK9和BST2对PRRSV复制的影响,并对其抗病毒机制进行探究。另外,揭示了PRRSV拮抗PCSK9和BST2抗病毒作用的机制,为深入了解PRRSV复制特性奠定了基础。
张宽[5]（2021）在《猪繁殖与呼吸综合征病毒转录调控序列顺式作用元件的鉴定及其在基因转录表达中的机制解析》文中研究表明猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）感染引起的严重接触性传染病,可导致母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状,俗称“蓝耳病”（Blue-eared disease）。猪繁殖与呼吸综合征病毒属于套式病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属。该病于20世纪90年代初首次被欧洲和美国报导,而我国于1996年首次报道了PRRS的出现,并且在2006年出现了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,HP-PRRSV）,2012年以来又陆续出现了NADC30-like PRRSV。目前PRRS已成为影响我国养猪业的一个重要问题。PRRSV采用非连续性转录的方式来进行亚基因组m RNA（Subgenomic m RNA,sg m RNA）的合成,病毒的转录调控序列（Transcription Regulatory Sequence,TRS）在这个过程中起着至关重要的作用。TRS分为病毒基因组的先导序列（Leader）和下游编码体（Body）的TRS。为了深入了解转录调控序列在病毒亚基因组转录和翻译过程中的作用,本研究首先对HP-PRRSV细胞传代致弱株Hu N4-F112和欧洲型LV株的Leader-Body结合位点进行详细鉴定与分析,分别鉴定了两种毒株Leader-TRS以及各个Body-TRS的序列及其在基因组中的相对位置,发现两种毒株的Body-TRS的核心寡核苷酸的序列和侧翼序列存在巨大差异,但是二者核心寡核苷酸的序列同源性较高,尤其是3?端两个碱基是一致的。本研究基于表达绿色荧光蛋白（EGFP）的Hu N4-F112-EGFP全长感染性克隆平台,构建了针对TRS6的一系列突变的全长c DNA克隆,并构建了将TRS6替换为其它Body-TRS的全长c DNA克隆。通过病毒拯救以及对病毒的生物学特性分析等发现,同时突变TRS6核心寡核苷酸3?端两个碱基的全长突变体克隆不能拯救出病毒;而单独缺失TRS6 5?端和3?端侧翼序列的全长突变体克隆可以拯救出病毒,但是侧翼序列缺失后拯救出的病毒相较于亲本病毒的滴度有所下降;5?端和3?端侧翼序列同时缺失的全长突变体克隆不能拯救出病毒。另一方面,将Hu N4-F112-EGFP的TRS6替换为TRS2,TRS3和TRS7之后,突变病毒能被拯救,并有相似的生长特性。但是其中替换为TRS2的重组病毒滴度相对较低;而将TRS6替换为TRS4和TRS5之后,则未能拯救出活病毒。通过对插入的不同的Body TRS区域的二级结构进行预测分析,结果发现TRS4和TRS5在插入位点区域与周边序列所形成的茎环结构,其核心寡核苷酸位于茎环结构的单链和茎结构上,这样的相对位置可能影响了TRS核心寡核苷酸与Leader-TRS的碱基互补配对的过程,进而影响了病毒的亚基因组转录,对病毒的拯救造成了阻碍,其具体的详细机制还需做进一步的研究。综上所述,本研究鉴定了两种不同PRRSV毒株的Leader-TRS和一系列Body-TRS的序列以及在基因组中的相对位置;证明了TRS cassette一级序列对于其调控作用的影响;同时也证明了ORF1b和ORF2a基因区中4种不同的Body-TRS cassette可以引导外源基因高效表达。该研究为进一步解析PRRSV转录调控元件和今后以PRRSV疫苗株为活病毒载体进行多价重组疫苗的研发奠定了基础。
张洋洋[6]（2021）在《RACK1基因在牛流行热病毒复制中的作用及机制的初步研究》文中研究说明牛流行热（Bovine ephemeral fever,BEF）能够引起病牛高热、呼吸困难、奶牛产奶量降低等症状,严重危害养牛业的健康发展。目前,国家防控牛流行热的主要措施为疫苗免疫,但防控效果欠佳,且尚无治疗该病的特效药物。牛流行热病毒（Bovine ephemeral fever virus,BEFV）是引起牛流行热的病原体,通过深入研究BEFV复制的分子机制,以期发现可行的药物靶点,从而为防控牛流行热提供重要的理论依据。活化的蛋白激酶C受体1（Receptor for activated C-kinase 1,RACK1）是一种结构保守的支架蛋白,在细胞的增殖、凋亡、自噬等生命活动中发挥重要的作用。尽管RACK1参与了多种病毒的复制,但RACK1对于BEFV复制的影响尚不清楚。因此,本论文主要围绕RACK1影响BEFV复制及作用机制展开以下研究:（1）RACK1促进BEFV复制。构建RACK1基因的过表达载体和稳定过表达RACK1基因的细胞系,用0.1MOI的BEFV感染过表达RACK1细胞系,通过TCID50检测接毒24 h后的病毒滴度。结果表明,过表达RACK1基因促进BEFV复制;同时,构建RACK1基因沉默载体和沉默RACK1基因的稳定细胞系,用0.1 MOI的BEFV感染该细胞系,通过TCID50检测接毒24 h后的病毒滴度发现,沉默RACK1基因明显抑制BEFV复制。上述结果表明,RACK1能够促进BEFV复制。（2）RACK1通过靶向MAVS分子抑制I型干扰素信号通路。用0.1 MOI的BEFV感染过表达RACK1基因的细胞系,感染24 h后通过RT-q PCR检测发现,RACK1抑制IFN-β和干扰素刺激基因的表达,负调控I型干扰素信号通路;随后,通过Western blot检测发现,RACK1显着抑制线粒体抗病毒蛋白（Mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS）的表达,而不影响TANK结合激酶1（TANK-binding kinase 1,TBK1）和干扰素调节因子3（Interferon regulatory factor,IRF3）的表达;同时,沉默RACK1显着增强了MAVS的表达,而不影响TBK1和IRF3的表达;此外,双荧光素酶报告基因系统检测发现,RACK1抑制MAVS介导的IFN-β启动子活性而不影响TRK1和IRF3-5D介导的IFN-β启动子活性;Western blot试验发现,RACK1以剂量依赖的方式下调MAVS的表达。以上结果表明,RACK1通过靶向MAVS抑制I型干扰素信号通路。（3）RACK1上调E3泛素连接酶STUB1的表达,并通过泛素蛋白酶体途径降解MAVS。RACK1能够降解MAVS,用蛋白酶体抑制剂MG132处理后MAVS的表达回调,说明RACK1通过泛素蛋白酶体途径降解MAVS;通过UbiBrowser软件预测到STUB1（STIP1 homology and U-box containing protein 1）可能是使MAVS发生泛素化的E3泛素连接酶,检测发现过表达RACK1上调STUB1的表达;通过Western blot检测发现,STUB1通过剂量依赖的方式降解MAVS,用MG132处理后,MAVS的表达回调,说明STUB1通过泛素蛋白酶体途径降解MAVS;通过Western blot发现,当同时过表达RACK1和STUB1时,明显促进MAVS的降解和泛素化水平;免疫共沉淀结果表明,在BEFV感染中,STUB1与MAVS相互作用,RACK1促进了STUB1和MAVS的结合,而RACK1和STUB1之间并不存在相互作用,说明RACK1降解MAVS的机制是上调STUB1的表达,从而促进MAVS的泛素化降解。综上所述,本研究率先发现RACK1可能通过上调E3泛素连接酶STUB1的表达降解MAVS,从而抑制IFN-β及干扰素刺激基因的表达,促进BEFV复制。本研究揭示了RACK1基因通过调节先天免疫反应影响BEFV复制的新机制,为抗病毒药物的研发提供新思路。
徐慧玲[7]（2021）在《基于病毒受体阻断的广谱抗病毒策略研究及其在CSFV和PRRSV防治中的应用》文中提出病毒性传染病严重威胁着公共卫生及人类与动物的健康。传统的抗病毒策略主要依赖于疫苗,例如灭活和减毒疫苗,但由于完整病毒的使用导致其生产和使用过程中存在较高的生物安全风险。此外,病毒结构蛋白免疫原性差和毒株序列高变异等原因导致某些疫苗的保护效果较差。病毒通过吸附、胞吞、脱壳、复制、装配与出芽过程完成其生命周期,而阻断病毒入侵宿主细胞被认为是最彻底有效的抗病毒策略。自20世纪70年代以来,基于病毒蛋白的结构和功能来干扰病毒与宿主受体的相互作用,继而实现安全有效的广谱抗病毒作用,逐渐成为抗病毒领域的研究热点。猪瘟（Classical swine fever,CSF）和猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）均是目前广泛流行的高度接触性传染病,对全世界的养猪业造成了重大的影响。猪瘟病毒（CSFV）的囊膜蛋白E2与病毒毒力紧密相关,是主要免疫原性蛋白,可介导CSFV入侵靶细胞,诱导机体产生高水平的中和抗体,且能从血清学上区分疫苗免疫和野毒感染动物,推动猪瘟的进一步净化。因此CSFV E2可作为病毒靶向阻断策略研究的优质模型。另一方面,可导致母猪繁殖障碍和仔猪呼吸系统障碍的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）,由于其高变异、易重组、免疫抑制等特性,导致现有病毒靶向阻断策略对其收效甚微,严重缺乏安全有效的疫苗及广谱抗病毒药物。研究表明清道夫受体CD163是PRRSV感染宿主细胞的主要受体,因此其可作为受体靶向阻断研究的理想模型。本研究分别基于病毒靶向和受体靶向的阻断策略,寻找安全有效广谱抗病毒药物,将为猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征的防控和净化提供新的思路。本研究中,首先以CSFV E2为模型评估病毒靶向策略的功效,一方面作为主动免疫策略,确定了携带新型信号肽的猪瘟E2ZJ亚单位疫苗的高效性和经济性。另一方面,开展被动免疫策略研究,基于E2ZJ的免疫优势,筛选获得3株靶向猪瘟病毒的广谱中和单抗,并评估了其体内外中和活性,抗病毒作用机制,抗原识别区域及功能。继而,为进一步提升阻断策略的通用保护作用,以CD163受体为模型评价了受体阻断策略的功效。制备了2株对PRRSV有广谱抗病毒作用的单抗,并对广谱抗病毒作用及其机制,体外的预防及治疗作用,抗原识别区域及其功能进行了进一步的评估。主要研究内容及结果如下:1.靶向病毒的主动免疫策略:新型高效猪瘟E2ZJ亚单位疫苗的研制鉴于猪瘟兔化弱毒疫苗不能区分免疫和感染动物,而猪瘟E2蛋白为主要的免疫原性蛋白。我们利用杆状病毒表达系统表达了融合新型信号肽的的E2蛋白。实验表明新型信号肽可促使E2蛋白在昆虫细胞中分泌表达。截短优化信号肽后发现,与其他截短信号肽相比,23aa长度的信号肽SPZJ（SP23）可诱导E2蛋白的表达量至少增加50%,且SPZJ信号肽对不同毒株的E2蛋白也具有促分泌功能。同等剂量不同毒株E2蛋白免疫小鼠后,经IFA和ELISA鉴定表明,与其他毒株的E2蛋白相比,E2ZJ可更早刺激机体产生猪瘟特异性抗体,且可诱导产生更高水平的中和抗体,其中和抗体效价在免疫28天后达到了1:2000。在仔猪攻毒实验中,单剂量免疫28天后,E2ZJ免疫组的猪瘟抗体阻断率高达75%以上,显着高于其他类型的猪瘟E2亚单位疫苗,同时产生了针对1型和2型毒株的高水平中和抗体。经强毒株攻毒后发现,与对照组比,免疫组均无猪瘟典型的体温反应、临床症状和组织病理变化,且单剂量5μg E2ZJ可对猪体提供针对石门毒株的100%保护作用。以上结果表明基于杆状病毒表达系统的猪瘟E2ZJ亚单位疫苗在蛋白表达量和免疫原性方面均具有优势,是一种经济高效的候选猪瘟亚单位疫苗。2.靶向病毒的被动免疫策略:猪瘟广谱中和单抗及其抗病毒机制的研究基于E2ZJ蛋白的免疫原性优势,通过传统的单克隆抗体筛选方法筛选出了一批具有中和活性的CSFV单克隆抗体。经IFA、Western-blot和ELISA鉴定后发现单抗6D10、8D8和3C12可特异性识别不同基因型的猪瘟病毒,且与不同型的CSFV E2蛋白均有较强的结合活性。此外三株单抗对不同的CSFV毒株具有广谱中和作用,且表现出良好的中和活性,即6.25μg/m L、3.125μg/m L和12.5μg/m L的剂量就可完全中和100 TCID50的CSFV,其中和作用呈一定的剂量依赖性。进一步的研究表明三株单抗具备多种高效的中和机制,即可抑制病毒的吸附和内化步骤从而阻断病毒的入侵。利用单抗与截短E2蛋白和E2蛋白突变体的反应性精确定位了三株单抗的线性中和表位分别为140TAVSPTTLR148、8YRYAIS13和254HECLIG259,其中后两个表位为首次发现的新表位。序列比对后发现三个表位在不同毒株中高度保守,表明其具有鉴别诊断猪瘟病毒的潜在价值。空间结构预测和病毒捕获实验结果显示140TAVSPTTLR148、8YRYAIS13表位位于囊膜蛋白表面。携带抗原表位的重组多肽可在PK-15细胞上抑制猪瘟病毒感染,表明相应的抗原表位位于受体结合域,参与了病毒入侵受体的过程。另外,在家兔体内评估了中和抗体的对猪瘟病毒的预防性和治疗性作用,这进一步证实了中和抗体在体内中和作用的有效性。以上研究为靶向猪瘟病毒的广谱抗病毒策略提供了新的思路,加深了对猪瘟病毒入侵机制的理解。3.靶向受体的抗病毒阻断策略:基于CD163受体的PRRSV广谱抗病毒策略研究CD163受体是PRRSV入侵的关键受体,基于CD163受体的SRCR5-9结构域筛选获得两株可特异性识别重组SRCR5-9蛋白以及PAMs和Marc-145细胞上CD163受体的单抗6E8和9A10。两株单抗均能呈剂量依赖性的抑制PRRSV毒株的感染,且对流行株和疫苗株均有不同程度的抑制作用。作为预防和治疗PRRSV的候选药物,两种抗体均能在在病毒附着前后成功抑制PRRSV的感染及其相关的NF-κB通路。两株单抗作用后均可导致PAMs和Marc-145细胞中CD163的转录水平显着下降。这可能是由于抗体与CD163受体结合从而封闭了蛋白酶作用位点,导致膜相关CD163过度积累并负反馈抑制CD163转录生成。利用单抗与截短SRCR5-9蛋白和SRCR5-9蛋白突变体的反应性精确定位了单抗6E8和9A10识别的关键氨基酸,分别位于SRCR5上的570SXDVGXV576和SRCR7上的Q797残基。该关键氨基酸在不同种属的CD163中高度保守。通过在不支持PRRSV感染的3D4细胞中过表达野生型CD163和关键氨基酸突变的CD163突变体进一步验证了这些氨基酸残基在PRRSV入侵CD163受体的关键作用。此外,基于实验室前期筛选到的CD163受体的抗原表位,在细胞上初步评估了靶向CD163受体的多肽疫苗的抗病毒作用。以上研究加深了对PRRSV与CD163受体作用的理解,并为PRRSV的预防和治疗提供了新的广谱抗病毒策略。
房军洋[8]（2021）在《PRRSV临床毒株的分离鉴定及鲎素抗PRRSV感染的作用》文中进行了进一步梳理猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）俗称蓝耳病,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）感染引起的一种以繁殖障碍和呼吸道感染为主要症状的传染病,严重危害猪业。PRRSV是一种易突变的RNA病毒,具有基因多样性,临床上常出现继发感染与混合感染。PRRSV被鉴定至今已有30余年,至今无有效的防控措施,制约了养殖业的经济效益。鲎素（Tachyplesin）是一种从东方鲎（Tachypleus tridentatus Leach）分离提取出来的2.3 kDa的阳离子抗菌肽（Antimicrobial peptide）,由17个氨基酸组成,是天然防御系统的重要组成部分。鲎素除了具有抗细菌、真菌作用,还具有抗病毒作用。研究发现,鲎素对水泡性口炎病毒、甲型H1N1流感病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒和神经坏死病毒具有抑制作用。鉴于PRRSV变异性强,对疑似PRRSV感染的样品进行病毒分离、鉴定,其中ORF5基因变异较大,根据ORF5的序列情况将北美洲型PRRSV分为四个谱系,因此可以针对ORF5来分析PRRSV遗传变异情况,探求该地猪繁殖与呼吸综合征流行特点及抗原变异规律。同时为研究鲎素对PRRSV感染的影响,以CRL2843CD163细胞和原代PAMs作为体外模型,采用Western blot和病毒滴度测定的方法,探讨鲎素对HP-PRRSV和临床分离毒株感染的影响,主要试验结果如下:1.PRRSV临床毒株的分离鉴定:对疑似PRRSV感染的7份临床样品进行ORF7基因检测,用其中一份阳性样品接种Marc-145细胞和PAMs,将分离得到的毒株命名为SD-LY并进行ORF5基因序列测定和遗传进化分析。试验结果表明:本试验分离毒株SD-LY与BJ-4毒株亲缘关系更近,同源性96.0%,根据进化树分析SD-LY属于lineage5。2.鲎素细胞毒性的测定:使用CCK-8试剂盒评价鲎素对CRL2843CD163细胞和PAMs的细胞毒性。试验结果表明:鲎素浓度在0～75 ng/mL无细胞毒性,当浓度为100ng/mL时会产生细胞毒性。3.鲎素对PRRSV复制的影响:CRL2843CD163细胞和PAMs分别接种PRRSV GD-HD毒株后,与鲎素孵育。试验结果表明:与对照组相比,当鲎素浓度为25 ng/mL时,PRRSV N蛋白的表达水平、子代病毒滴度无显着变化,当鲎素浓度为50 ng/mL和75 ng/mL时,PRRSV N蛋白的表达水平、子代病毒滴度显着降低,呈浓度依赖性。4.鲎素对PRRSV感染活性的影响:PRRSV GD-HD毒株与鲎素共孵育后,将混合物与CRL2843CD163细胞或PAMs共孵育。试验结果表明:与对照组相比,鲎素浓度为25 ng/mL、50 ng/mL、75 ng/mL时,PRRSV N蛋白的表达水平、子代病毒滴度都显着降低,呈浓度依赖性。5.鲎素对PRRSV易感细胞的易感性影响:鲎素与CRL2843CD163细胞或PAMs共孵育后,接种PRRSV GD-HD毒株。试验结果表明:当鲎素浓度为25 ng/mL、50 ng/mL、75 ng/mL时,PRRSV N蛋白的表达水平、子代病毒滴度都无显着变化。6.鲎素对PRRSV临床分离株复制的影响:CRL2843CD163细胞接种PRRSV SD-LY毒株后,与不同浓度的鲎素孵育。试验结果表明:鲎素浓度为25 ng/mL、50 ng/mL、75 ng/mL时,PRRSV N蛋白的表达水平、子代病毒滴度都显着降低,呈浓度依赖性。综上所述,本研究分离鉴定得到一株PRRSV临床毒株并将其命名为SD-LY,根据ORF5序列对比分析、鉴定SD-LY属于lineage 5谱系。鲎素呈浓度依赖性地抑制PRRSV在CRL2843CD163细胞或PAMs中复制,主要是通过抑制病毒的感染活性抑制PRRSV在细胞中的复制,为鲎素作为抗PRRSV治疗药物的研发奠定了理论和试验基础。
黄瑶[9]（2021）在《基于呼吸道病毒感染监测探讨中医疫疠之邪》文中研究表明疠气,疫疠之气,是一类具有强烈致病性和传染性的外感病邪,是中医病因学里重要组成部分。疠气作为中医温病病因的提出最早源自晋代葛洪（283-363）《肘后备急方》,后代医家也有所发挥,直至到十七世纪的明末时期,吴又可在《瘟疫论》里真正指出了疠气是脱离六淫邪气以外的另一种外感病因,是一种客观存在的,人眼所观测不到的细小致病性物质,它的存在和气候、地域、时节都密切相关,正是它的传播导致了疾病的流行,这比十九世纪西方提出的传染病学说早了足足200多年,这在当时的历史条件下实属难得,古人为中医病因学的发展开辟了一个新的天地,至今仍有深刻的理论及重要实践价值,但是迄今为止,关于疠气引起的各种疾病的流行病学特点是什么,流行本质是什么,相关研究少。急性呼吸道病毒感染（Acuterespiratory tract infection,ARTI）是最常见的病毒性感染性疾病,常见为流行性感冒、病毒性肺炎等,疫气不同,其导致的疫病也不相同,一气一病,每一种疫疠之气所导致的疫病,都有别于其他疫病的临床特征和病变规律,搞清楚每一种疫疠之气的发病特点,分析其致病相关因素,探讨其病因病机,对于中医药在疫病的辨证治疗及“未病先防”方面都有着积极的意义。因此我们首次将中医疫病疠气研究与呼吸道病毒感染主动监测相结合,以流行性感冒、病毒性肺炎及新型冠状病毒肺炎为切入点,从传染特点、发病时间、发病地域、病因属性、症状体征、体质因素与传变规律、康复与复发特点、病毒微观定量与西医辨病等8个方面探讨中医疫疠之邪,以期丰富、完善呼吸道病毒感染疫病的中医辨证体系,为中医药在呼吸道传染病防治防未病上提供有益的借鉴。为研究流感疠气的流行特点,本实验室依托国家流感网络实验室平台,开展流感样病例主动监测,随机抽检本地区国家级流感监测哨点医院25059例流感样病例（Influenza-like illness,ILI）咽拭子标本,开展荧光PCR病原学检测、MDCK细胞病毒分离、分离毒株的HA基因序列进化分析及氨基酸位点分析,得出本地区甲型流感HA基因进化特点、氨基酸分子变异特点,结果显示本地区流感流行优势毒株多为两种或两种以上组合,每年优势毒株不尽相同;进化与变异分析显示,近几年分离到的新甲H1N1毒株以6B为主,只有两株为6C;H3N2以3C为主,2014年以后以3C.2a为主,同年分离的毒株序列并不完全在一个进化分支上,部分与疫苗株相隔较远;无论是新甲H1N1还是H3N2,在HA的抗原性及受体结合位点均出现了变异,提示病毒抗原性及毒性出现潜在变化。收集病例监测基本信息及同期气候、环境等资料,结合病原学监测数据,利用SPSS20.0建立数据库,发现流感疠气流行特点呈现明显的冬春季节性,与温度、相对湿度、空气质量PM10呈正相关,O3指数呈负相关。7-17岁学生为流感易感人群,主要症状以发热、咳嗽、恶寒、头痛为主,流感疠气病因属性为“风、寒、湿、热”。7-17岁学生,所处封闭教室环境,疠气易于聚集传播,是其易感原因。流感疠气流行受环境时节影响巨大,其主要病因为气温低,温差大,人体正气下降,寒邪入侵是主要诱因（H3N2兼有湿邪）,此时疠气本身受环境的“寒”“风”“燥”及空气中可悬浮颗粒物PM10增多,造成疠气的活跃及传播范围变广,人体卫外功能下降,正气不足,易于感受外邪而发病。为研究病毒性肺炎疠气流行特点、病因属性、发病相关因素,本实验室于2017年1月-2020年7月开展常见呼吸道病毒病毒性肺炎主动监测,共随机抽检1109例住院肺炎病例咽拭子标本,实时荧光定量PCR检测五种常见呼吸道病毒核酸,包括流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病、副流感III型病毒、人肠道病毒。我们发现病毒性肺炎全年都有检出,女性比男性占比高,年龄为0-6岁孩童高发,流行季节为冬季,主要症状为以鼻塞、咳嗽、恶寒、乏力、憋喘为主,其病因属性为“风、寒、湿、热”。主要病原为流感病毒及呼吸道合胞病毒,此类病毒正常情况下感染机体只会诱发普通上呼吸道症状,甚至不发病,其病因病机主要是因为机体本身正气不足,造成脏腑功能不足,外感疠气而发病,与疠气流行有一定关联,但不是主要原因。0-6岁幼儿为主要易感人群,正因为幼儿免疫力较低,体内正气不足,在幼托机构等聚集场所疠气聚集,容易交叉感染呼吸道病毒,易进展为肺炎。病毒性肺炎流行与PM2.5指数相关,病毒可以吸附在PM2.5颗粒,从而在空气中停留时间长,飘散距离远,而易于传播。为探讨本地新型冠状病毒肺炎疠气流行特点、病因属性、发病相关因素,我们于2020年1月21日-3月3日开展新型冠状病毒肺炎病例主动监测筛查,共筛查8433份病例,发现37名新型冠状病毒感染者,其中23名为新型冠状病毒肺炎确诊病例,14名为无症状感染者,横断面研究群体调查方法收集这37名感染者基本信息,实验室检测数据、临床症状、发病时间、出院时间、流行病史、血液指标及治疗情况进行分析,探讨使用数字QuantStudioTM3D数字PCR芯片,建立一种更高灵敏度、准确度的新型冠状病毒数字PCR检测方法,并将其应用于本地区新型冠状病毒感染者主动追踪监测,与实时荧光PCR同步检测感染者的咽、肛、血液、尿液标本共计1190份,定位不同时间新型冠状病毒肺炎疠气藏身之处,及其排毒时间。发现新型冠状病毒感染者发病时间集中在:1月15日-2月11日,季节为冬季,节气为小寒、大寒、立春,六气为终之气与初之气,平均温度5.15±2.60℃,平均湿度80.7±8.59%,确诊病例中以轻型和普通型为主,重症仅为一例。临床症状主要为发热与咳嗽,占比均为91.3%,确诊病例湿邪症状身重肢倦,乏力胸闷的症状最多,占43.48%,37位感染者有7位在出院或隔离解除后又出现“复阳”乃至反复“复阳”特征,比例为18.92%,距发病99天,仍有病例咽拭子核酸检测为阳性,复阳反复次数最多达5次。新型冠状病毒感染者长期追踪检测结果显示,发病初期采集呼吸道标本,尽量采集下呼吸道标本;发病中后期及恢复期,采集呼吸道标本及肛拭子标本双份标本。血液标本和尿液标本不适合作为新型冠状病毒肺炎监测采样标本类型。建立的数字PCR检测方法灵敏度、准确性均优于现时使用的荧光PCR核酸检测方法,可以与现时荧光PCR方法相结合,提高病毒检出率,明确荧光PCR结果不明确标本的判定,减少样本的采样次数。流感病毒与病毒性肺炎,都具有流行季节性,病因属性为“风、寒、湿、热”,易感人群为幼童、学生,二者的发病均与正气有关,但流感的发病与疠气流行程度相关更大,而病毒性肺炎发病受正气影响更大。新型冠状肺炎暴发于冬季,寒冷高湿节气暴发,全民易感,病机特点为湿性疠气,初络即入肺,湿性泛滥致疫毒郁肺,其发病与正气相关不大。但病毒间歇性排毒造成的“复阳”,从中医角度,可归属于“差后病复”,“除毒务尽”、“扶助正气”、“改善体质”三大原则可以有效防止该现象发生。新型冠状病毒肺炎疠气流行与温度、湿度、地域关系密切,病因属性以“湿、寒”为主,叶天士在《温热论》中说“温邪上受,首先犯肺”,这是温病学的经典理论。湿邪主要伤脾胃,这是已有理论的共识,但这次的新型冠状病毒肺炎的病因以寒湿为主,主要病位却在肺,疠气的性质虽以温热者居多,但也有属于寒性者,如寒疫病,根据新型冠状病毒肺炎我们提出“湿疫病”,值得进一步研究。本病的无症状感染者多见,确诊患者治愈后多次复阳,为疫情防范增加了难度,针对新型冠状病毒肺炎疠气隐匿反复特点提高检测能力,时刻关注疠气之变化,从提高易感人群免疫力入手,开展主动监测,早发现早诊断早治疗,中西医结合治未病,方能有效防控疫情。
石达[10]（2020）在《猪急性腹泻综合征冠状病毒诱导细胞自噬的机制研究》文中提出冠状病毒（Coronavirus,CoVs）这一大类病毒广泛存在于自然界中,常见禽类、哺乳动物以及人类都易感。自2003年SARS-CoV（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus,SARS-CoV）的流行到2012年的MERS-CoV（Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus,MERS-CoV）的出现,再到2020年最大的“黑天鹅事件”-新型冠状病毒疫情的暴发,均引起了全世界人类的恐慌。2010-2013年猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）以及2017年新发现的猪急性腹泻综合征冠状病毒（Swine Acute Diarrhea Syndrome Coronavirus,SADS-CoV）,更是重创了世界畜牧业,至此,人们才对冠状病毒感染后致病的严重程度以及快速的传播能力给予了足够的重视。SADS-CoV作为一种新发现的冠状病毒,属于冠状病毒科Alpha冠状病毒属,是有囊膜包被的单股正链RNA病毒。自2017年首次在中国猪场发现和报道以来,已经在广东清远地区猪场引发了严重的仔猪腹泻疫情。病毒作为一种专性细胞内寄生物,其在感染过程中必定会与宿主的胞内应答发生相互作用。细胞自噬（Autophagy）作为一种保守的胞内适应性应答,在维持细胞稳态,促进新陈代谢方面起着举足轻重的作用。它可将细胞内的衰老细胞器、外源微生物等成分包裹在一个称为自噬体的双层膜结构中,运送至溶酶体进行降解回收。自噬是机体对抗病原体的天然防御机制,但最近越来越多的证据表明许多病毒已进化出多种策略抵抗、逃逸、甚至利用细胞自噬促进自身增殖,如流感病毒、丙型肝炎病毒、登革热病毒、轮状病毒等。对于SADS-CoV而言,其复制感染与细胞自噬之间的相互作用及其启动机制便是本研究中要探索的问题。首先,采用三种经典方法对SADS-CoV感染Vero E6和ST细胞后是否诱导自噬进行了检测,包括透射电镜观察自噬体的形成,激光共聚焦检测荧光聚点的变化以及Western blot分析LC3的转化。结果表明,与对照相比,SADS-CoV感染后诱导Vero E6细胞产生自噬体样双层膜结构,GFP-LC3荧光聚点显着累积,而且LC3发生了明显的类别转换,同时证明SADS-CoV诱导的自噬严格依赖于病毒的复制,由此证实SADS-CoV感染可以诱导细胞自噬的发生。其次,进一步研究了细胞自噬对病毒复制的影响。结果显示利用自噬诱导剂Rapamycin处理细胞诱导自噬反应后,上调了病毒的复制;利用自噬阻断剂3-MA处理细胞降低自噬反应后,下调了病毒的复制。敲低自噬关键性基因ATG5和LC3抑制自噬后,病毒N蛋白表达显着的减少,同时上清中子代病毒的含量也显着的降低。上述结果证明了SADS-CoV的有效复制是诱导自噬的关键因素,并可以利用自噬促进自身增殖。再次,对SADS-CoV是否诱导完整自噬潮进行了分析。自噬潮,即自噬的整个动态连续的过程,可通过p62的降解、LC3-Ⅱ的周转、自噬小体和溶酶体共定位分析等综合评价。研究结果显示,SADS-CoV感染促进了自噬底物p62的降解;3D活细胞激光共聚分析发现SADS-CoV感染促进了自噬小体和溶酶体的融合;同时SADS-CoV感染后GFP-LC3标记的自噬小体和LysoTracker标记的溶酶体出现了明显的共定位;最后配合使用溶酶体抑制剂CQ,发现LC3-Ⅱ和p62出现了明显的蓄积,以上结果表明SADS-CoV感染诱导了自噬的起始和自噬性降解过程,即SADS-CoV感染可诱导完整的自噬潮。最后,为了深入探索SADS-CoV感染激活自噬的机制,本研究对内质网应激与自噬之间关系进行了系统分析。结果显示SADS-CoV感染在体内和体外均能诱导内质网应激,同时可激活PERK-EIF2S1、ATF6和IRE1三条信号通路,进一步利用特异性抑制剂或激活剂,RNA干扰和关键蛋白过表达发现仅IRE1信号通路在SADS-CoV诱导细胞自噬过程中起到关键性作用。综上所述,本研究阐明了（1）SADS-CoV感染诱导Vero E6和ST细胞自噬;（2）自噬过程有利于SADS-CoV的复制;（3）SADS-CoV可通过UPR的IRE1信号途径激活自噬。研究结果推动了SADS-CoV与宿主相互作用领域的研究,为探索SADS-CoV发病机制提供了全新的视角,为抗病毒药物的筛选奠定了基础。
二、猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因和流感病毒HA基因的联合表达及应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因和流感病毒HA基因的联合表达及应用（论文提纲范文）
（1）SARS-CoV-2编码蛋白抑制宿主Ⅰ型干扰素应答机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 新型冠状病毒 |
| 1 新型冠状病毒的出现与疫情的发展 |
| 2 SARS-CoV-2 的“溢出”与传播 |
| 3 SARS-CoV-2 的基因组结构 |
| 4 SARS-CoV-2 编码蛋白在病毒生活史中的主要作用 |
| 5 冠状病毒与宿主因子的互作及对先天免疫应答的抑制 |
| 6 结语 |
| 第2章 宿主先天免疫与病毒逃逸 |
| 1 宿主抗病毒先天免疫 |
| 2 干扰素应答 |
| 3 蛋白泛素化 |
| 4 结语 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 SARS-CoV-2 编码蛋白对Ⅰ型干扰素产生通路的抑制作用 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 SARS-CoV-2 编码蛋白对Ⅰ型干扰素信号转导通路的抑制作用 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 ORF7a泛素化修饰增强其抑制Ⅰ型干扰素信号转导活性 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 高致病性冠状病毒NSP1/6抑制Ⅰ型干扰素信号转导通路的差异 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）QH-08PRRS分离株Caspase-8介导的凋亡途径及实时定量PCR方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| summary |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 PRRS病原特征及防控技术研究 |
| 1 PRRSV非结构蛋白及结构蛋白的基本功能 |
| 1.1 PRRSV非结构蛋白的基本功能 |
| 1.1.1 PRRSV 的 5' UTR 和 3' UTR 的分子特性 |
| 1.1.2 PRRSV ORF1a 和 ORF1b 的特征 |
| 1.2 PRRSV结构蛋白的基本特征 |
| 2 PRRSV致病过程中的天然免疫通路 |
| 2.1 细胞凋亡 |
| 2.2 NF-κB通路 |
| 2.3 干扰素反应 |
| 2.4 Toll样受体信号通路 |
| 3 PRRSV在中国的流行趋势 |
| 3.1 PRRSV-1 型在中国的流行趋势 |
| 3.2 PRRSV-2 型在国内的流行趋势 |
| 4 PRRSV的防控 |
| 4.1 PRRS的检测技术 |
| 4.1.1 PRRS病毒分离 |
| 4.1.2 PRRSV血清学检测方法 |
| 4.1.2.1 间接荧光抗体试验 |
| 4.1.2.2 免疫过氧化物酶单层试验 |
| 4.1.2.3 酶联免疫吸附测定 |
| 4.1.3 PRRSV核酸检测方法 |
| 4.2 PRRS 的疫苗 |
| 4.2.1 现有疫苗 |
| 4.2.2 新型疫苗研发 |
| 4.2.2.1 DNA疫苗 |
| 4.2.2.2 植物疫苗 |
| 4.2.2.3 病毒样颗粒的疫苗 |
| 4.3 疫苗佐剂 |
| 5 抗病毒因子 |
| 5.1 二氧化氯抑制PRRSV的复制 |
| 5.2 化学抗病毒因子对 PRRSV 的抑制作用 |
| 5.3 蛋白质因子对 PRRSV 的抑制作用 |
| 6 本课题研究目标和任务 |
| 第二章 QH-08 PRRSV分离株全序列特征 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 样品 |
| 1.3 序列比对及分析 |
| 1.4 ORF2-ORF7 序列的变异分析 |
| 1.5 ORF2-ORF7 序列二级结构 |
| 2 结果 |
| 2.1 QH-08 的基因组基本特征 |
| 2.2 34株PRRSV-2型的ORF2-7序列的进化变异 |
| 2.2.1 ORF 2 进化和变异 |
| 2.2.2 ORF3 分子进化和变异 |
| 2.2.3 ORF4 分子进化和变异 |
| 2.2.4 ORF5 分子进化和变异 |
| 2.2.5 ORF6 分子进化和变异 |
| 2.2.6 ORF7 分子进化和变异 |
| 2.3 ORF1α1b分子进化和变异 |
| 2.4 二级结构分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 盐酸吗啉胍激活caspase-8 凋亡途径抑制QH-08PRRSV的复制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞、病毒和试剂 |
| 1.2 Quantitative real-time RT-PCR(q PCR)检测 |
| 1.3 病毒感染试验 |
| 1.4 Annexin V和 PI双重染色检测细胞死亡 |
| 1.5 siRNA实验 |
| 1.6 Westernblot检测 |
| 1.7 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 盐酸吗啉胍对 PRRSV 复制和细胞死亡的抑制作用 |
| 2.2 盐酸吗啉胍诱导TLR3 凋亡信号通路 |
| 2.3 盐酸吗啉胍激活 caspase-8 和 caspase-3 途径 |
| 2.4 Mcl-1 蛋白是抑制 PRRSV 复制的主要因子 |
| 3 讨论 |
| 第四章 不同PRRSV疫苗对QH-08 毒株的保护性研究 |
| 1 病毒和疫苗 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物实验 |
| 2.2 临床检查 |
| 2.3 血清学检测 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 临床观察 |
| 3.2 病毒 RNA 的检测 |
| 3.3 检测 PRRSV 的抗体 |
| 4 讨论 |
| 第五章 基于QH-08 分离株的一步法real-time RT-PCR检测方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株与质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 试剂盒 |
| 1.4 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 real-time RT-PCR方法 |
| 2.1.1 引物 |
| 2.1.2 反应体系 |
| 2.2 多重RT-PCR检测方法 |
| 2.2.1 多重RT-PCR检测方法反应所用引物 |
| 2.2.2 RT-PCR反应体系和反应流程 |
| 2.3 检测结果判定 |
| 2.4 敏感性试验 |
| 2.5 特异性试验 |
| 2.6 临床样品 |
| 2.7 保存期试验 |
| 2.7.1 试剂盒性状检测 |
| 2.7.2 重复性试验 |
| 2.7.3 敏感性试验 |
| 2.7.4 特异性性试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 方法建立及标准曲线 |
| 3.2 敏感性试验 |
| 3.3 特异性试验 |
| 3.4 临床样品检测 |
| 3.5 保存期试验 |
| 3.5.1 重复性试验 |
| 3.5.2 试剂盒性状试验 |
| 3.5.3 敏感性试验 |
| 3.5.4 保存期特异性检测 |
| 4 讨论 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 导师简介 |
（3）α-单月桂酸甘油酯对猪繁殖与呼吸综合征病毒抑制机制的探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 文献综述 |
| 1.猪繁殖与呼吸综合征病毒概述 |
| 2.猪繁殖与呼吸综合征病毒的免疫学及其免疫逃逸/抑制机制 |
| 2.1 宿主对病毒感染的免疫应答反应 |
| 2.2 PRRSV感染对先天性免疫应答的调节 |
| 2.3 PRRSV感染对TLR7/8-Myd88-NF-κB信号通路的调节 |
| 3.猪繁殖与呼吸综合征病毒的防治现状 |
| 4. α-单月桂酸甘油酯概述 |
| 4.1 α-单月桂酸甘油酯的特性 |
| 4.2 α-单月桂酸甘油酯的抗菌功能 |
| 4.3 α-单月桂酸甘油酯的免疫调节功能 |
| 4.4 α-单月桂酸甘油酯的抗病毒功能 |
| 5.研究的目的与意义 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第一章 α-单月桂酸甘油酯对猪繁殖与呼吸综合征病毒的抑制效果 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 数据分析与处理 |
| 2.试验结果 |
| 2.1 病毒扩培、纯化、验证及毒力测定 |
| 2.2 α-GML最大无细胞毒性浓度确定 |
| 2.3 α-GML的不同处理方法对PRRSV病毒的抑制效果 |
| 3.讨论 |
| 3.1 α-GML处理PRRSV的抑制效果 |
| 第二章 α-单月桂酸甘油酯对猪繁殖与呼吸综合征病毒的抑制机制 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 数据分析与处理 |
| 2.试验结果 |
| 2.0 α-GML与 PRRSV共处理对病毒活力的影响 |
| 2.1 α-GML与 PRRSV共处理对病毒膜结构与细胞受体的影响 |
| 2.2 α-GML与 PRRSV共处理对TLR7/8-Myd88-NF-κB/IFN-α信号通路的影响 |
| 3.讨论 |
| 3.1 α-GML对 PRRSV病毒结构、受体及活力的影响 |
| 3.2 α-GML对 TLR7/8-Myd88-NF-κB/IFN-α通路的调节作用 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 中英文对照表 |
| 附录Ⅱ 试验所需引物 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（4）膜蛋白PCSK9和BST2抑制PRRSV复制的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征病概述 |
| 1.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒病原学概述 |
| 1.2.1 PRRSV基因组结构 |
| 1.2.2 PRRSV复制、转录概述 |
| 1.2.3 PRRSV非结构蛋白及其功能 |
| 1.2.4 PRRSV结构蛋白及其功能 |
| 1.3 PCSK9 的研究概况 |
| 1.3.1 PCSK9的发现 |
| 1.3.2 PCSK9的结构组成及功能 |
| 1.3.3 影响PCSK9表达的因素 |
| 1.3.4 抑制PCSK9表达的方法 |
| 1.3.5 PCSK9与病毒相互作用关系的研究进展 |
| 1.4 BST2 的研究进展 |
| 1.4.1 BST2的结构特点 |
| 1.4.2 BST2的抗病毒作用机制 |
| 1.4.3 病毒拮抗BST2 抗病毒活性的机制 |
| 1.5 其他与PRRSV复制相关的细胞因子研究进展 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 PCSK9抑制PRRSV复制机制的研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 病毒和细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 PCSK9结构域及点突变真核表达质粒的构建 |
| 2.1.5 免疫荧光验证过表达PCSK9对PRRSV复制影响试验 |
| 2.1.6 Western blot验证过表达PCSK9对PRRSV复制影响试验 |
| 2.1.7 SYBR RT-qPCR验证PCSK9对IFN-β影响试验 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 过表达pCAGGS-PCSK9-Flag能够抑制PRRSV复制 |
| 2.2.2 PCSK9的C端结构域具有抗病毒活性 |
| 2.2.3 PCSK9主要通过溶酶体途径降解PRRSV受体CD163 |
| 2.2.4 PCSK9主要通过K48/K63 位泛素化修饰方式抑制CD163表达 |
| 2.2.5 PCSK9能够促进干扰素产生 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 PRRSVNSP11拮抗PCSK9的抗病毒作用与其核酸内切酶活性相关 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 病毒和细胞 |
| 3.1.2 主要抗体 |
| 3.1.3 主要酶和试剂 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.1.5 pGL3-Basic-PCSK9 promoter的构建 |
| 3.1.6 双荧光素酶报告基因验证PCSK9启动子活性 |
| 3.1.7 双荧光素酶报告基因检测Nsp11对PCSK9 启动子活性影响试验 |
| 3.1.8 免疫共沉淀验证PCSK9与Nsp11互作试验 |
| 3.1.9 Nsp11点突变质粒的构建 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 PRRSV能够抑制内源性PCSK9的表达 |
| 3.2.2 PRRSVNsp11能够负调节PCSK9表达 |
| 3.2.3 PRRSVNsp11对PCSK9的抑制作用呈明显的剂量依赖性 |
| 3.2.4 PRRSVNsp11与PCSK9不互作 |
| 3.2.5 PRRSV对PCSK9启动子没有影响 |
| 3.2.6 Nsp11不通过泛素蛋白酶体途径以及溶酶体途径抑制PCSK9 表达 |
| 3.2.7 PRRSVNsp11抑制PCSK9表达与其核酸内切酶活性相关 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 BST2 抑制PRRSV复制的机制研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 病毒和细胞 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 质粒的构建 |
| 4.1.5 siRNA干扰内源性BST2的表达试验 |
| 4.1.6 BST2对病毒吸附过程的影响试验 |
| 4.1.7 BST2对病毒进入过程的影响试验 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 过表达BST2能抑制PRRSV复制 |
| 4.2.2 BST2对PRRSV的抑制作用呈明显的剂量依赖性 |
| 4.2.3 siRNA BST2能够促进PRRSV复制 |
| 4.2.4 BST2不影响病毒的吸附和进入过程 |
| 4.2.5 BST2影响病毒进入后的复制过程 |
| 4.2.6 BST2糖基化位点突变不影响BST2的抗病毒活性 |
| 4.2.7 BST2能够抑制E蛋白的表达 |
| 4.2.8 BST2能够抑制BST2肉豆蔻酰化失活的突变蛋白的表达 |
| 4.2.9 BST2不能通过泛素蛋白酶体以及溶酶体途径抑制E蛋白的表达 |
| 4.2.10 BST2能够抑制E蛋白m RNA的表达 |
| 4.2.11 BST2对于Nsp12的抑制作用尤为明显 |
| 4.2.12 BST2对于Nsp12的抑制作用呈明显的剂量依赖关系 |
| 4.2.13 BST2不与Nsp12互作 |
| 4.2.14 BST2对Nsp12mRNA水平没有影响 |
| 4.2.15 BST2能通过泛素蛋白酶体途径影响Nsp12表达 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 PRRSV拮抗BST2抗病毒机制的研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 病毒和细胞 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.1.4 激光共聚焦验证BST2与Nsp5 的定位关系试验 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 BST2在病毒感染早期上调,感染中后期下调 |
| 5.2.2 PRRSV能够拮抗BST2的抗病毒作用 |
| 5.2.3 PRRSVNsp5/Nsp11/Nsp12能够影响BST2表达 |
| 5.2.4 PRRSVNsp11抑制BST2的表达与其核酸内切酶活性相关 |
| 5.2.5 PRRSVNsp5能够与BST2互作 |
| 5.2.6 PRRSVNsp5能够影响BST2细胞质及细胞膜中的蛋白表达 |
| 5.2.7 PRRSVNsp5能够抑制BST2的表达 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 PCSK9单克隆抗体的制备及应用 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 病毒和细胞 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 PCSK9重组蛋白的诱导表达 |
| 6.1.4 PCSK9重组蛋白的纯化 |
| 6.1.5 PCSK9单克隆抗体的制备 |
| 6.1.6 间接ELISA |
| 6.1.7 单克隆抗体亚型的鉴定 |
| 6.1.8 肺泡巨噬细胞的分离和培养 |
| 6.1.9 Western Blot |
| 6.1.10 间接免疫荧光(IFA) |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 PCSK9重组蛋白的纯化 |
| 6.2.2 PCSK9单克隆抗体2A2B12的亚型鉴定 |
| 6.2.3 PCSK9单克隆抗体2A2B12抗体表位的初步鉴定 |
| 6.2.4 应用单克隆抗体发现PRRSV能够影响PCSK9表达 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）猪繁殖与呼吸综合征病毒转录调控序列顺式作用元件的鉴定及其在基因转录表达中的机制解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征概述 |
| 1.1.1 猪繁殖与呼吸综合征 |
| 1.1.2 PRRS的病原学 |
| 1.1.3 PRRSV病毒的传染性 |
| 1.1.4 PRRSV病毒的发病机制 |
| 1.1.5 PRRSV感染引发的先天性免疫反应 |
| 1.1.6 PRRSV基因组结构与组成 |
| 1.1.7 PRRSV的蛋白结构与功能 |
| 1.1.8 PRRSV的抗体应答 |
| 1.1.9 PRRSV的复制与不连续性转录 |
| 1.2 PRRSV反向遗传系统概述 |
| 1.2.1 PRRSV反向遗传系统 |
| 1.2.2 PRRSV感染性c DNA克隆的构建 |
| 1.2.3 反向遗传系统的应用 |
| 1.3 TRS对外源基因在PRRSV基因组间区中稳定表达的调控作用 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 第二章 高致病性PRRSV传代致弱株Hu N4-F112 和欧洲型LV株转录调控序列的鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞与病毒 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞总RNA的提取 |
| 2.2.2 cDNA的合成 |
| 2.2.3 目的基因片段的扩增 |
| 2.2.4 目的基因与载体连接 |
| 2.2.5 重组质粒的转化和测序 |
| 2.3 结果分析 |
| 2.3.1 PRRSV亚基因组m RNA的扩增 |
| 2.3.2 PRRSV的 Leader-TRS和 Body-TRS测序结果的鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 猪繁殖与呼吸综合征病毒TRS-Body(TRS-B)cassette调控作用的初步解析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞与病毒 |
| 3.1.2 主要抗体 |
| 3.1.3 主要实验试剂及仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 重组质粒的构建原理 |
| 3.2.2 重组质粒的构建 |
| 3.2.3 菌液鉴定 |
| 3.2.4 质粒的提取 |
| 3.2.5 体外转录 |
| 3.2.6 病毒拯救 |
| 3.2.7 传代病毒突变位点的鉴定 |
| 3.2.8 重组病毒的多步生长曲线的绘制 |
| 3.2.9 Western Blot鉴定 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 含有系列Body-TRS突变的全长感染性克隆的构建 |
| 3.3.2 全长突变体克隆的拯救 |
| 3.3.3 拯救出的病毒的测序鉴定 |
| 3.3.4 拯救出的病毒的蛋白表达 |
| 3.3.5 拯救出病毒的多步生长曲线的绘制 |
| 3.3.6 插入的不同Body TRS区域的二级结构分析结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）RACK1基因在牛流行热病毒复制中的作用及机制的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 综述 |
| 1.1 牛流行热病毒综述 |
| 1.1.1 BEF简介 |
| 1.1.2 BEF流行病学 |
| 1.1.3 BEFV的结构及基因功能 |
| 1.1.4 BEFV的复制机制 |
| 1.1.5 BEF的防控 |
| 1.2 RACK1 综述 |
| 1.2.1 RACK1 简述 |
| 1.2.2 RACK1 基因的结构和功能 |
| 1.2.3 RACK1 与病毒的关系 |
| 1.2.4 RACK1 参与天然免疫的研究 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 第二章 RACK1对BEFV复制的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞和病毒毒株 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 试剂配制 |
| 2.1.4 主要仪器及设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 RACK1 过表达载体的构建 |
| 2.2.3 RACK1 shRNA载体的构建 |
| 2.2.4 重组载体转染细胞 |
| 2.2.5 细胞系的构建 |
| 2.2.6 蛋白免疫印迹实验 |
| 2.2.7 BEFV感染RACK1 过表达及干扰细胞系样本的制备 |
| 2.2.8 TCID_(50)测定 |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 过表达RACK1 促进病毒复制 |
| 2.3.2 沉默RACK1 抑制病毒复制 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 RACK1 通过靶向MAVS调控天然免疫 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验细胞和病毒毒株 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 试剂配制 |
| 3.1.4 主要仪器及设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞总RNA的提取和反转录 |
| 3.2.2 荧光定量PCR检测IFN-β和 ISGs的表达 |
| 3.2.3 双荧光素酶报告基因系统 |
| 3.2.4 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 RACK1 抑制Ⅰ型干扰素信号通路 |
| 3.3.2 RACK1 通过靶向MAVS抑制Ⅰ型干扰素信号通路 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 RACK1 降解MAVS的分子机制 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验细胞和病毒毒株 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 试剂配制 |
| 4.1.4 主要仪器及设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 MAVS和 STUB1 过表达载体的构建 |
| 4.2.2 药物处理实验 |
| 4.2.3 免疫共沉淀 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 RACK1 通过泛素蛋白酶体途径降解MAVS |
| 4.3.2 RACK1 上调E3 泛素连接酶STUB1 的表达 |
| 4.3.3 STUB1 通过泛素蛋白酶体途径降解MAVS |
| 4.3.4 STUB1 促进RACK1对MAVS的泛素化降解作用 |
| 4.3.5 RACK1 促进MAVS和 STUB1 相互作用 |
| 4.3.6 RACK1与STUB1 之间没有相互作用 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 发表的学术论着 |
| 致谢 |
（7）基于病毒受体阻断的广谱抗病毒策略研究及其在CSFV和PRRSV防治中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 阻断病毒与宿主受体作用的广谱抗病毒策略 |
| 1.1 靶向病毒的广谱抗病毒阻断策略 |
| 1.2 靶向受体的广谱抗病毒阻断策略 |
| 2 猪瘟病毒及猪瘟研究进展 |
| 2.1 猪瘟病毒的研究进展 |
| 2.2 猪瘟的研究进展 |
| 3 猪繁殖与呼吸综合征病毒及其相关受体研究进展 |
| 3.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒的概述 |
| 3.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒的防控 |
| 3.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒的相关受体 |
| 3.4 CD163 受体及其功能 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第一章 靶向病毒的主动免疫策略:新型高效猪瘟E2ZJ亚单位疫苗的研制 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞和病毒 |
| 1.2 载体和菌株 |
| 1.3 抗体与试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 猪瘟E2ZJ蛋白真核表达载体的构建 |
| 2.2 重组杆粒的构建 |
| 2.3 重组E2ZJ蛋白的表达及纯化 |
| 2.4 分泌型信号肽的优化 |
| 2.5 分泌型信号肽的通用性 |
| 2.6 序列比对分析 |
| 2.7 抗原制备 |
| 2.8 不同基因型猪瘟E2 蛋白的免疫原性比较 |
| 2.9 猪瘟E2ZJ亚单位疫苗的最小免疫剂量的确定 |
| 2.10 猪瘟E2ZJ亚单位疫苗的免疫原性评价 |
| 2.11 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组SP-E2ZJ蛋白的表达及鉴定 |
| 3.2 猪瘟重组E2ZJ蛋白表达条件的优化 |
| 3.3 新型信号肽的截短优化 |
| 3.4 新型信号肽的通用性 |
| 3.5 不同基因型猪瘟E2 蛋白的免疫原性的比较 |
| 3.6 猪瘟E2ZJ亚单位疫苗的仔猪攻毒保护实验 |
| 4 讨论 |
| 第二章 靶向病毒的被动免疫策略:猪瘟广谱中和单抗及其抗病毒机制的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞和病毒 |
| 1.2 载体与菌株 |
| 1.3 试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 单克隆杂交瘤细胞株的制备和筛选 |
| 2.2 单克隆抗体的反应性鉴定 |
| 2.3 单克隆抗体亚型的鉴定 |
| 2.4 单克隆抗体的纯化 |
| 2.5 单克隆抗体中和效价的评估 |
| 2.6 细胞吸附内化实验 |
| 2.7 单克隆抗体识别抗原表位的鉴定 |
| 2.8 抗原表位多肽的封闭试验 |
| 2.9 与CSFV E2 多肽互作的宿主蛋白的筛选 |
| 2.10 抗原表位的空间分布 |
| 2.11 抗原表位的保守性分析 |
| 2.12 中和单抗的兔体保护实验 |
| 2.13 荧光定量PCR方法测定病毒基因组拷贝数 |
| 3 结果 |
| 3.1 E2ZJ蛋白免疫后小鼠的抗体水平 |
| 3.2 猪瘟E2 单克隆抗体的制备及反应性鉴定 |
| 3.3 单抗6D10、8D8和3C12 的亚型鉴定和纯化 |
| 3.4 单抗6D10、8D8和3C12 的广谱中和活性 |
| 3.5 单抗6D10、8D8和3C12 的中和作用机制 |
| 3.6 单抗6D10、8D8和3C12 抗原表位的鉴定 |
| 3.7 抗原表位多肽的抗病毒作用 |
| 3.8 单抗6D10、8D8和3C12 抗原表位的生物信息学分析 |
| 3.9 中和单抗在兔体内的预防和治疗作用 |
| 3.10 与CSFV E2 多肽互作的宿主蛋白的筛选 |
| 4 讨论 |
| 第三章 靶向受体的抗病毒阻断策略:基于CD163 受体的PRRSV广谱抗病毒策略研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞和病毒 |
| 1.2 菌株与载体 |
| 1.3 试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 猪原代肺泡巨噬细胞(PAMs)的制备 |
| 2.2 CD163 SRCR5-9 蛋白的真核表达 |
| 2.3 CD163 SRCR5-9 蛋白的病毒阻断试验 |
| 2.4 CD163 单克隆抗体的制备 |
| 2.5 CD163 单克隆抗体的反应性鉴定 |
| 2.6 CD163 单克隆抗体的受体阻断作用 |
| 2.7 基于CD163 单抗8H2和7H4 的表位多肽抗病毒作用 |
| 2.8 单抗6E8、9A10 的抗原表位鉴定 |
| 2.9 单抗6E8、9A10 的抗原表位的生物信息学分析 |
| 2.10 CD163 及其突变体过表达细胞系的建立 |
| 3 结果 |
| 3.1 CD163 SRCR5-9 的抗病毒作用 |
| 3.2 CD163 单克隆抗体的反应性鉴定 |
| 3.3 单抗6E8和9A10对PRRSV的抗病毒作用 |
| 3.4 单抗6E8和9A10 对不同PRRSV毒株的广谱抗病毒作用 |
| 3.5 单抗6E8和9A10对PRRSV的预防及治疗作用 |
| 3.6 单抗6E8和9A10 的抗病毒作用机制 |
| 3.7 单抗6E8和9A10 抗原表位的鉴定 |
| 3.8 基于单抗8H2和7H4 表位多肽的抗病毒作用 |
| 3.9 单抗6E8和9A10 表位的生物信息学分析 |
| 3.10 ~(570)SXDVGXV~(576)和Q~(797)是PRRSV入侵的关键结合位点 |
| 4 讨论 |
| 全文总结及展望 |
| 创新性 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间科研成果 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（8）PRRSV临床毒株的分离鉴定及鲎素抗PRRSV感染的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究进展 |
| 1.1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒概况 |
| 1.1.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒的病原学特征 |
| 1.1.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒受体研究进展 |
| 1.1.4 猪繁殖与呼吸综合征病毒防控技术研究进展 |
| 1.2 鲎素的研究进展 |
| 1.2.1 鲎素的研究概况 |
| 1.2.2 鲎素的生物学作用和特性 |
| 1.2.3 鲎素的作用机理 |
| 1.3 本研究目的与意义 |
| 第二章 PRRSV临床毒株的分离鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品采集 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 PRRSV的引物设计 |
| 2.2.2 RNA的提取 |
| 2.2.3 cDNA合成 |
| 2.2.4 PCR检测 |
| 2.2.5 病毒分离 |
| 2.2.6 分离株TCID_(50) 测定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 样品RT-PCR检测结果 |
| 2.3.2 细胞病变 |
| 2.3.3 SD-LY毒株TCID_(50)测定 |
| 2.3.4 SD-LY毒株ORF5 基因序列测定和同源性分析 |
| 2.3.5 ORF5 序列遗传进化树分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 鲎素对PRRSV感染的作用研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 鲎素I、细胞和病毒 |
| 3.1.2 主要试剂与耗材 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 Marc-145 细胞复苏及传代培养 |
| 3.2.2 CRL2843~(CD163)细胞复苏及传代培养 |
| 3.2.3 原代PAMs复苏 |
| 3.2.4 PRRSV的增殖 |
| 3.2.5 鲎素的细胞毒性试验 |
| 3.2.6 鲎素对PRRSV感染的细胞的作用 |
| 3.2.7 Western blot |
| 3.2.8 病毒滴度测定(TCID_(50)) |
| 3.3 数据分析及统计 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 鲎素的细胞毒性测定 |
| 3.4.2 鲎素对PRRSV复制的作用 |
| 3.4.3 鲎素对PRRSV感染活性的影响 |
| 3.4.4 鲎素对PRRSV易感细胞易感性的影响 |
| 3.4.5 鲎素对PRRSV临床毒株复制的作用 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 结论及展望 |
| 参考文献 |
| 附录 SD-LY的ORF5测序结果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）基于呼吸道病毒感染监测探讨中医疫疠之邪（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 基于流感主动监测探讨中医疫疠之邪 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 样本来源 |
| 1.2 资料收集及诊断标准 |
| 1.3 实验室检测 |
| 1.4 数据统计与分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 监测采样情况 |
| 2.2 病原学监测 |
| 2.3 流感病例症状及病因属性 |
| 2.4 流感疠气流行因素调查 |
| 3. 分析与讨论 |
| 3.1 流感流行人群分布 |
| 3.2 流感症状及病因属性分布 |
| 3.3 流感疠气流行型别及进化变异 |
| 3.4 流感疠气四季分布 |
| 3.5 流感疠气节气分布 |
| 3.6 流感疠气六气分布 |
| 3.7 流感疠气与气象、空气质量因素相关性 |
| 3.8 流感疠气流行病因 |
| 4. 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 基于病毒性肺炎主动监测探讨中医疫疠之邪 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 样本来源 |
| 1.2 资料收集 |
| 1.3 咽拭子采样 |
| 1.4 实验室检测 |
| 1.5 数据统计与分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 监测采样情况 |
| 2.2 病原检测结果 |
| 2.3 病毒性肺炎流行人群分布 |
| 2.4 病毒性肺炎临床症状统计及病因属性 |
| 2.5 病毒性肺炎疠气流行因素调查 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 病毒性肺炎流行人群分布 |
| 3.2 病毒性肺炎症状及病因属性分布 |
| 3.3 病毒性肺炎疠气四季分布 |
| 3.4 病毒性肺炎疠气节气的分布 |
| 3.5 病毒性肺炎疠气六气分布 |
| 3.6 病毒性肺炎疠气与气象、空气质量因素相关性 |
| 3.7 病毒性肺炎流行病因 |
| 4. 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 基于新型冠状肺炎主动监测及3D数字PCR方法探讨中医疫疠之邪 |
| 一 基于新型冠状病毒肺炎主动监测探讨中医疫疠之邪 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 病例筛查 |
| 1.2 标本采集 |
| 1.3 实验室检测 |
| 1.4 资料收集 |
| 2. 结果 |
| 2.1 新型冠状病毒肺炎监测情况 |
| 2.2 新型冠状病毒肺炎流行特点 |
| 2.3 实验室检测及治疗 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 二 基于3D数字PCR技术探讨新型冠状肺炎疫疠之邪 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 仪器与试剂 |
| 1.2 样本来源 |
| 1.3 建立新型冠状病毒3D数字PCR检测方法 |
| 1.4 新型冠状病毒感染者追踪监测 |
| 2. 结果 |
| 2.1 3DPCR反应条件的确定 |
| 2.2 3D数字PCR准确性及灵敏度试验 |
| 2.3 3D数字PCR重复性试验 |
| 2.4 3D数字PCR特异性试验 |
| 2.5 新型冠状病毒感染病例追踪监测结果 |
| 2.6 不同病程阶段,新型冠状病毒感染者不同样本类型核酸阳性检出率 |
| 2.7 新型冠状病毒感染者“复阳”比例 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 新型冠状病毒3D数字PCR检测方法建立 |
| 3.2 新型冠状病毒在不同类型生物标本中的分布特点 |
| 3.3 新型冠状病毒感染者“复阳”现象之探究 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 文献综述 新型冠状病毒检测技术研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表论文目录 |
| 致谢 |
（10）猪急性腹泻综合征冠状病毒诱导细胞自噬的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 冠状病毒概述 |
| 1.2 猪急性腹泻综合征冠状病毒研究进展 |
| 1.2.1 SADS-CoV致病的临历床症状 |
| 1.2.2 宏基因组学分析 |
| 1.2.3 SADS-CoV的分子特征 |
| 1.2.4 SADS-CoV感染宿主细胞受体研究 |
| 1.2.5 SADS-CoV动物回归试验 |
| 1.2.6 SADS-CoV诊断方法的研究 |
| 1.3 自噬的研究进展 |
| 1.3.1 自噬的生物学功能和分子机制 |
| 1.3.2 自噬的检测方法 |
| 1.4 自噬的信号调节 |
| 1.5 病毒感染与自噬的相互关系 |
| 1.5.1 自噬的抗病毒作用 |
| 1.5.2 自噬对病毒复制的促进 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 第二章 SADS-CoV感染通过UPRIRE1通路诱导自噬并促进病毒的复制 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 病毒、细胞和质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 相关溶液配制 |
| 2.2.2 真核表达质粒的构建 |
| 2.2.3 利用透射电镜观察自噬体 |
| 2.2.4 pAcGFP-LC3B转染细胞检测病毒对LC3的影响 |
| 2.2.5 Western blot对病毒蛋白及自噬相关基因的检测 |
| 2.2.6 激光共聚焦观察 |
| 2.2.7 3D活细胞成像 |
| 2.2.8 药物配制及细胞处理 |
| 2.2.9 CCK-8试验检测药物对Vero E6及ST细胞活性的检测 |
| 2.2.10 siRNA干扰 |
| 2.2.11 蛋白过表达或siRNA干扰对病毒复制影响 |
| 2.2.12 SADS-CoV滴度的测定 |
| 2.2.13 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 SADS-CoV感染Vero E6细胞后自噬小体的形成 |
| 2.3.2 SADS-CoV感染Vero E6细胞后自噬囊泡的形成 |
| 2.3.3 SADS-CoV感染Vero E6和ST细胞后LC3蛋白的转化 |
| 2.3.4 SADS-CoV复制过程参与诱导细胞自噬 |
| 2.3.5 诱导自噬促进SADS-CoV的复制,而抑制自噬降低SADS-CoV的复制 |
| 2.3.6 敲低自噬关键因子ATG5和LC3B降低SADS-CoV的复制 |
| 2.3.7 SADS-CoV感染Vero E6和ST细胞引起自噬底物p62的降解 |
| 2.3.8 SADS-CoV感染Vero E6诱导autolysosome的形成 |
| 2.3.9 SADS-CoV感染Vero E6后LysoTracker初LC3共定位分析 |
| 2.3.10 SADS-CoV感染Vero E6和ST细胞LC3-Ⅱ周转分析 |
| 2.3.11 SADS-CoV感染诱导内质网应激并激活PERK-EIF2S1、IRE1和ATF6三条通路 |
| 2.3.12 内质网应激参与SADS-CoV诱导的细胞自噬 |
| 2.3.13 PERK-EIF2S1通路抑制SADS-CoV复制,但不参与SADS-CoV诱导的细胞自噬 |
| 2.3.14 ATF6信号通路不影响SADS-CoV的复制及SADS-CoV诱导的细胞自噬 |
| 2.3.15 SADS-CoV通过激活IRE1信号通路诱导细胞自噬促进SADS-CoV的复制 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 SADS-CoV感染诱导细胞自噬 |
| 2.4.2 细胞自噬促进SADS-CoV的复制 |
| 2.4.3 SADS-CoV感染诱导完整的自噬潮 |
| 2.4.4 SADS-CoV感染诱导内质网应激,并通过IRE1通路激活细胞自噬促进病毒的复制 |
| 第三章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因和流感病毒HA基因的联合表达及应用（论文参考文献）
- [1]SARS-CoV-2编码蛋白抑制宿主Ⅰ型干扰素应答机制研究[D]. 曹增国. 吉林大学, 2021(01)
- [2]QH-08PRRS分离株Caspase-8介导的凋亡途径及实时定量PCR方法的建立[D]. 丁耀忠. 甘肃农业大学, 2021(01)
- [3]α-单月桂酸甘油酯对猪繁殖与呼吸综合征病毒抑制机制的探究[D]. 蓝俊虹. 浙江农林大学, 2021
- [4]膜蛋白PCSK9和BST2抑制PRRSV复制的机制研究[D]. 张玉娇. 中国农业科学院, 2021
- [5]猪繁殖与呼吸综合征病毒转录调控序列顺式作用元件的鉴定及其在基因转录表达中的机制解析[D]. 张宽. 中国农业科学院, 2021(09)
- [6]RACK1基因在牛流行热病毒复制中的作用及机制的初步研究[D]. 张洋洋. 山东师范大学, 2021
- [7]基于病毒受体阻断的广谱抗病毒策略研究及其在CSFV和PRRSV防治中的应用[D]. 徐慧玲. 浙江大学, 2021
- [8]PRRSV临床毒株的分离鉴定及鲎素抗PRRSV感染的作用[D]. 房军洋. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [9]基于呼吸道病毒感染监测探讨中医疫疠之邪[D]. 黄瑶. 扬州大学, 2021
- [10]猪急性腹泻综合征冠状病毒诱导细胞自噬的机制研究[D]. 石达. 中国农业科学院, 2020(01)