猪德尔塔冠状病毒入侵的分子机制及疫苗免疫保护的初步评价

论文摘要

猪德尔塔冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）属于冠状病毒科,δ冠状病毒属成员,是一种新型肠道冠状病毒,可引起不同日龄的猪只感染并表现出腹泻、呕吐、脱水的临床症状。疫苗免疫,尤其是母猪的被动免疫是预防和控制腹泻性病毒（PEDV、TGEV、PoRV和PDCoV）感染最有效的方法。目前,PDCoV缺少商品化的疫苗,对疫病的防控无疫苗可用。因此,灭活疫苗的制备及免疫评价对PDCoV的防控显得尤为重要。本研究首先在5日龄SPF猪上对PDCoV分离株PDCoV NH P10的致病性进行研究,结果表明以104TCID50口服感染1 mL病毒,攻毒后24 h,出现典型的腹泻的临床症状。剖检显示肠壁变薄,内有淡黄色液体。病理切片HE染色表明,空肠和回肠的肠绒毛在感染后72 h出现明显的萎缩、变短和脱落。空肠和回肠是PDCoV感染的主要肠段。与文献报道不同的是PDCoV NH株感染后没有出现呕吐的临床症状。同时,本研究在猪回肠细胞系IPI-2I细胞上研究了PDCoV入侵细胞的分子机制,结果表明PDCoV可以通过两种途径感染细胞,一种是由胰酶介导的细胞膜表面途径,另外一种是由组织蛋白酶L（CTSL）和组织蛋白酶B（CTSB）介导的内吞体途径。进一步研究表明,通过细胞膜表面入侵的效率比内吞体途径高10100倍。病毒感染之后,在细胞上及感染PDCoV的小肠组织中均提高了CTSL和CTSB的表达,并在体外细胞水平上提高了CTSB的酶活性。为评价灭活疫苗的被动免疫保护效果,通过后海穴注射的免疫途径,分别在产前40 d和产前20 d对妊娠母猪进行免疫,在母猪分娩后让新生仔猪采食初乳,并在5日龄进行攻毒。根据临床发病、病理损伤及排毒情况对灭活疫苗的被动免疫保护效果进行评价。结果表明,母猪免疫灭活疫苗后在血清及母乳中可诱导IgG及中和抗体应答,仔猪通过吸食母乳可获得被动免疫保护。攻毒实验表明,灭活疫苗可为仔猪提供87.1%的被动免疫保护率。除了被动免疫为仔猪提供被动免疫保护外,主动免疫可以提高猪只的免疫水平,减少PDCoV感染的风险。首先我们模拟自然感染,对25日龄的SPF猪进行了口服感染实验并监测抗体水平。结果表明口服感染后第5天可引起25日龄断奶猪产生腹泻的临床症状。抗体检测结果表明,在第3次口服感染后抗体水平迅速升高,同时可检测到高水平的IgA。为评价主动免疫的效果,我们采取了三种免疫策略:灭活疫苗两次免疫（K+K）;活疫苗首免,灭活苗加免（L+K）;活疫苗两次免疫（L+L）。结果表明,三种免疫策略在免疫后两周,中和抗体转阳,在加强免疫后抗体水平迅速升高。K+K免疫组的中和抗体水平要高于其它两组。并且在免疫后两周K+K免疫组在血清中就可以检测到高水平的IFN-γ,说明灭活疫苗免疫也可以激活细胞免疫应答。组织毒攻毒实验结果表明,K+K免疫组的保护效果要高于其它两组。以上结果说明采用灭活疫苗间隔两周免疫两次的免疫策略可以诱导较好的中和抗体应答并为猪只提供保护。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 英文缩略表
• 第一章 引言
•   1.1 冠状病毒概述
•   1.2 猪德尔塔冠状病毒
•   1.3 PDCoV病原学
•     1.3.1 PDCoV病毒粒子及基因组结构
•     1.3.2 PDCoV与 PEDV/TGEV的抗原交叉反应
•     1.3.3 PDCoV的细胞培养及传代
•     1.3.4 PDCoV致病性及组织嗜性
•     1.3.5 PDCoV的病理生理学
•     1.3.6 PDCoV发病时间及排毒
•     1.3.7 PDCoV致病机制
•   1.4 PDCoV分子流行病学
•     1.4.1 德尔塔冠状病毒的发现及遗传演化
•     1.4.2 PDCoV的感染和流行情况
•   1.5 PDCoV诊断方法
•   1.6 冠状病毒入侵机制研究进展
•   1.7 肠道粘膜免疫机制
•     1.7.1 肠道粘膜结构及粘膜免疫
•     1.7.2 肠道粘膜免疫效应因子
•     1.7.3 被动免疫及―肠-乳腺-SIgA‖轴
•   1.8 中和抗体
•   1.9 TGEV的被动免疫机制
•   1.10 PEDV和 TGEV的疫苗免疫策略
•   1.11 免疫应答
•   1.12 本研究的目的意义
• 第二章 PDCoV NH株致病性研究
•   2.1 材料和方法
•     2.1.1 主要实验试剂
•     2.1.2 毒株、细胞和抗体
•     2.1.3 主要仪器设备
•     2.1.4 实验猪
•     2.1.5 荧光定量PCR引物及方法建立
•     2.1.6 拭子中病毒RNA的提取
•     2.1.7 组织中病毒RNA的提取（TRIzol法）
•     2.1.8 PDCoV阴阳性血清的筛选及鉴定
•     2.1.9 PDCoV全病毒包被的间接ELISA方法的建立
•     2.1.10 致病性实验设计
•   2.2 结果
•     2.2.1 基于N基因的荧光定量PCR方法的建立
•       2.2.1.1 荧光定量标准曲线
•       2.2.1.2 灵敏性试验
•       2.2.1.3 特异性试验
•     2.2.2 基于PDCoV全病毒的间接ELISA方法的建立
•       2.2.2.1 间接ELISA方法的具体操作步骤
•       2.2.2.2 抗原最佳包被浓度及血清稀释度的确定
•       2.2.2.3 临界值的确定
•     2.2.3 PDCoV NH株第10 代致病性
•       2.2.3.1 临床症状
•       2.2.3.2 剖检变化
•       2.2.3.3 病理组织变化
•       2.2.3.4 免疫组织化学及冰冻切片检测抗原分布
•       2.2.3.5 PDCoV感染后排毒及组织病毒含量
•   2.3 讨论
• 第三章 PDCoV入侵机制研究
•   3.1 材料和方法
•     3.1.1 细胞、质粒和病毒
•     3.1.2 抑制剂
•     3.1.3 荧光定量PCR检测细胞内sgNS7a
•     3.1.4 间接免疫荧光
•     3.1.5 细胞融合实验
•     3.1.6 抑制剂实验
•     3.1.7 蛋白酶活性检测
•   3.2 结果
•     3.2.1 标准曲线的建立
•     3.2.2 抑制剂最佳浓度的确定
•     3.2.3 PDCoV通过两种方式入侵细胞
•     3.2.4 CTSL和 CTSB切割活化S蛋白
•     3.2.5 下调CTSL和 CTSB的表达抑制病毒的入侵
•     3.2.6 PDCoV感染对CTSL和 CTSB的影响
•     3.2.7 过表达CTSL和 CTSB促进病毒的感染
•     3.2.8 胰酶可以切割活化PDCoV S蛋白
•     3.2.9 胰酶处理促进病毒的感染
•     3.2.10 PDCoV入侵机制
•   3.3 讨论
• 第四章 PDCoV灭活苗被动免疫效果评价
•   4.1 材料和方法
•     4.1.1 主要实验试剂
•     4.1.2 毒株、细胞、质粒和抗体
•     4.1.3 灭活苗的制备
•     4.1.4 主要仪器设备
•     4.1.5 实验猪
•     4.1.6 PDCoV S蛋白胞外域的表达纯化
•     4.1.7 间接免疫荧光法确定PDCoV IgG阴性血清
•     4.1.8 PDCoV IgG及 SIgA ELISA检测方法的建立
•       4.1.8.1 抗原最佳包被浓度和二抗最佳稀释度的确定
•       4.1.8.2 临界值的确定
•     4.1.9 中和试验
•     4.1.10 PDCoV半数感染量的确定
•     4.1.11 PDCoV被动免疫实验设计
•   4.2 结果
•     4.2.1 PDCoV S蛋白胞外域的表达纯化
•     4.2.2 PDCoV IgG及 SIgA ELISA检测方法的建立
•       4.2.2.1 PDCoV阴性血清的筛选
•       4.2.2.2 PDCoV阴性初乳的筛选
•       4.2.2.3 IgG ELISA方法抗原最佳包被浓度和最佳二抗稀释度的确定
•       4.2.2.4 SIgA ELISA方法抗原最佳包被浓度和最佳二抗稀释度的确定
•       4.2.2.5 IgG和 SIgA临界值的确定
•     4.2.3 PDCoV半数感染量的确定
•       4.2.3.1 临床症状
•       4.2.3.2 剖检变化
•       4.2.3.3 病理组织变化
•       4.2.3.4 免疫组化检测病毒抗原分布
•       4.2.3.5 PDCoV感染后排毒及组织病毒含量
•     4.2.4 PDCoV灭活苗被动免疫评价
•       4.2.4.1 免疫程序及分组
•       4.2.4.2 攻毒后临床症状
•       4.2.4.3 剖检变化
•       4.2.4.4 病理组织变化及抗原检测
•       4.2.4.5 攻毒后粪便拭子及肠组织病毒含量
•       4.2.4.6 母猪血清及乳汁中的抗体水平检测
•       4.2.4.7 仔猪血清中的抗体水平检测
•     4.2.5 PDCoV灭活苗被动免疫保护机制
•   4.3 讨论
• 第五章 PDCoV灭活苗及活疫苗主动免疫效果评价
•   5.1 材料和方法
•     5.1.1 主要实验试剂
•     5.1.2 病毒株和细胞
•     5.1.3 PDCoV组织毒的制备
•     5.1.4 实验动物
•     5.1.5 PDCoV口服感染抗体监测实验
•     5.1.6 PDCoV NH P120 致病性研究
•     5.1.7 33日龄断奶猪发病模型的建立
•     5.1.8 5日龄仔猪主动免疫及攻毒实验
•     5.1.9 口服感染或主动免疫后特异性抗体的检测
•     5.1.10 中和试验
•     5.1.11 细胞因子的检测
•     5.1.12 猪外周血PBMC的分离
•     5.1.13 流式细胞术检测T细胞IFN-γ应答
•   5.2 结果
•     5.2.1 口服感染25 日龄SPF猪的临床症状及抗体检测
•       5.2.1.1 口服感染后的临床症状
•       5.2.1.2 荧光定量检测粪便排毒
•       5.2.1.3 口服感染后的特异性抗体的检测
•     5.2.2 PDCoV NHP120致病性实验
•       5.2.2.1 临床症状及剖检变化
•       5.2.2.2 病理组织切片观察
•       5.2.2.3 免疫组织化学观察
•       5.2.2.4 粪便拭子及肠组织病毒含量检测
•     5.2.3 33日龄断奶猪组织毒攻毒实验
•       5.2.3.1 临床症状及剖检变化
•       5.2.3.2 病毒载量检测
•       5.2.3.3 病理组织切片及免疫组化结果
•       5.2.3.4 33日龄断奶猪组织毒发病标准
•     5.2.4 PDCoV 主动免疫实验
•       5.2.4.1 疫苗免疫后的特异性抗体的检测
•       5.2.4.2 血清中细胞因子的检测
•       5.2.4.3 T细胞IFN-γ应答
•     5.2.5 主动免疫后的攻毒实验
•       5.2.5.1 临床症状
•       5.2.5.2 剖检变化
•       5.2.5.3 粪便拭子和组织中的病毒含量
•       5.2.5.4 病理切片及免疫组化结果
•   5.3 讨论
• 第六章 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 博士论文

作者: 张家林

导师: 冯力

关键词: 猪德尔塔冠状病毒,灭活疫苗,被动免疫,主动免疫,病毒入侵

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院

基金: 科技创新工程经费,十三五国家重点研发计划“猪冠状病毒性腹泻的免疫保护机制研究(2016YFD0500103)”

分类号: S852.651

总页数: 112

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