狂犬病疫苗免疫前后TCR/BCR CDR3免疫组库高通量测序研究

论文摘要

狂犬病是世界上最致命的人类健康危害之一,每年有数万人死于狂犬病。狂犬病病毒（Rabies Virus,RABV）是一种典型的嗜神经病毒,是狂犬病的病原体。虽然在预防方面取得了很大进展,但RABV引起致命疾病的机制仍不清楚,这限制了狂犬病病毒疫苗的设计和改进。目前已有研究表明,T细胞在控制RABV复制中具有重要保护作用,而B细胞则产生相应抗体介导体液免疫应答。T、B细胞依赖其特异性细胞受体（TCR/BCR）识别RABV抗原。但是目前对狂犬病疫苗免疫后机体T、B淋巴细胞介导的免疫反应和TCR/BCR CDR3免疫组库的变化情况尚不明确。因此,本研究通过高通量测序的方法分析免疫狂犬疫苗后志愿者的T、B淋巴细胞受体CDR3谱系的特征和变化,为进一步研究B淋巴细胞产生的抗体奠定了基础。此外,免疫组库测序可更好地帮助我们理解对狂犬病疫苗免疫后机体免疫系统的变化,并将为新一代诊断标记物、免疫疗法以及新型疫苗的开发和研制提供理论指导,进而为后续分析RABV感染人体免疫系统后T、B细胞介导免疫反应的作用提供基础性数据。本课题对6个志愿者分别注射商业化狂犬病毒疫苗,分离外周血单核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMC）,提取PBMC总RNA,对总RNA进行逆转录获得cDNA,以cDNA为模板,针对TCR/BCR进行多重PCR（multiplex PCR）,产物通过Illumina HiseqtmXten（novaseq）平台进行高通量测序,生物信息学分析接种疫苗前后T、B细胞CDR3区中V（D）区、J区和V-J组合的多样性基因使用频率分布;高频CDR3氨基酸序列以及对应多肽的性质;前20种高频氨基酸克隆型;CDR3重叠序列。结果显示,接种疫苗后,BCR、TCR谱中总克隆型增加,克隆扩增程度增高;BCR/TCR CDR3氨基酸免疫库多样性增加;IGHV、IGHJ、TRBV、TRBJ及V-J组合的表达频率改变,其中,在BCR谱中IGHJ4是表达率最高的J基因,IGHV5-51是表达率最高的V基因;TCR谱中TRBJ1-1是表达率最高的J基因,TRBV29-1是表达率最高的V基因;TCR谱中,接种疫苗后出现了三个新的高频CDR3克隆型,推测与疫苗免疫应答有关;同一志愿者CDR3高频序列多样,其对应多肽的等电点（pI）和平均亲水性（GRAVY）值的范围相对较广,BCR的CDR3高频谱中多肽大部分具有亲水性,在CDR3和配体之间的相互作用表现出亲水性。而TCR的CDR3高频谱中亲水性多肽与疏水性多肽数量大致相当;同一志愿者中独特克隆型的重叠比率大于不同志愿者之间的重叠比率。研究得出以下结论:与接种疫苗前相比,接种疫苗后T、B细胞总克隆扩增程度增加,免疫组库多样性较高。接种狂犬疫苗后TCR、BCR CDR3受体库发生变化,提示T细胞与B细胞在机体抵御狂犬病感染中的作用。可以通过免疫组库测序从核苷酸序列、氨基酸序列和V-J组合情况全面了狂犬疫苗免疫前和免疫后BCR、TCR CDR3的多样性和特征,可帮助我们理解狂犬疫苗免疫后机体期间免疫系统的变化,为将来了解狂犬病疫苗引起的适应性免疫应答机制,分析T、B细胞在保护宿主免受RABV感染和改善疫苗反应的生物学作用提供基础性数据。

论文目录

• 中文摘要
• abstract
• 中英文缩写表
• 引言
• 第一篇 文献综述
•   第1章 狂犬病概述
•     1.1 狂犬病现状
•     1.2 狂犬病病原学
•     1.3 狂犬病毒感染过程概述
•     1.4 狂犬病预防概述
•     1.5 狂犬病疫苗研究进展
•   第2章 免疫组库概述
•     2.1 B细胞与B细胞受体概述
•     2.2 T细胞与T细胞受体概述
•     2.3 BCR与TCR的区别与联系
•   第3章 高通量测序与免疫组库测序概述
•     3.1 高通量测序进展
•     3.2 免疫组库测序进展与应用
•       3.2.1 评估免疫库的多样性
•       3.2.2 CDR3区片段长度的分布特征
•       3.2.3 CDR3区域的氨基酸分布
•       3.2.4 V（D）J区基因表达和配对
• 第二篇 研究内容
•   第1章 狂犬病疫苗免疫人B细胞受体库的高通量测序分析
•     1.1 材料与设备
•       1.1.1 疫苗
•       1.1.2 主要试剂与耗材
•       1.1.3 实验设备与仪器
•     1.2 方法
•       1.2.1 免疫志愿者
•       1.2.2 分离PBMC
•       1.2.3 RNA提取
•       1.2.4 cDNA合成与MultiplexPCR扩增
•       1.2.5 高通量测序
•       1.2.6 生物信息学分析
•     1.3 实验结果
•       1.3.1 PBMC总 RNA提取琼脂糖凝胶电泳检测
•       1.3.2 志愿者测序数据的总结
•       1.3.3 RABV疫苗免疫前后BCRH CDR3多样性
•       1.3.4 RABV疫苗免疫前后V、J区基因的表达频率和V-J的配对情况
•       1.3.5 RABV疫苗免疫前后BCR谱高频CDR3氨基酸序列分析
•       1.3.6 RABV疫苗免疫前后BCRH CDR3重叠序列
•     1.4 讨论
•     1.5 小结
•   第2章 狂犬病疫苗免疫人T细胞受体库的高通量测序分析
•     2.1 材料与设备
•     2.2 方法
•     2.3 结果
•       2.3.1 志愿者测序数据的总结
•       2.3.2 RABV疫苗免疫前后TCRB CDR3多样性
•       2.3.3 RABV疫苗免疫前后V、J区基因的表达频率和V-J的配对情况
•       2.3.4 RABV疫苗免疫前后TCR谱的高频CDR3氨基酸序列分析
•       2.3.5 RABV疫苗免疫前后TCRB CDR3重叠序列
•     2.4 讨论
•     2.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果
• 导师简介
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 谢孟泽

导师: 杨松涛

关键词: 狂犬病疫苗,免疫组库,高通量测序,互补性决定区

来源: 吉林大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 吉林大学

基金: 国家重点研发计划“病原诱导获得性免疫应答及其调控机制研究”(2016YFD0500405)

分类号: S852.4

总页数: 103

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