论文摘要
角膜缘干细胞（LSCs）是一种可以被用来作为干细胞生物学基础研究的理想材料。迄今为止,LSCs特异性标志物仍未被确立。本文旨在以小鼠为实验动物模型,利用免疫组化、转录组学和蛋白质组学分析,探究LSCs标志物及其干性相关通路。本研究首先通过HE染色观察角膜缘上皮组织学结构,发现了小鼠角膜缘上皮基底中并未存在Vogt氏栅状皱纹（POV）结构,说明小鼠LSCs可能具有自己独特的niche结构。同时,利用角膜上皮细胞（CECs）、结膜上皮细胞和LSCs已知的可能标志物,对小鼠的眼角膜组织进行免疫组化染色,发现LSCs标志物具有独特的空间表达模式,并推测该结果与年龄因素相关。我们遂以出生前和出生后不同发育时间的小鼠角膜、角膜缘组织为样品进行HE染色和免疫组化染色。通过HE染色观察,发现小鼠角膜发育早期以上皮下基质发育为主,在P14眼睑睁开后,光刺激促进角膜上皮发育,转为以角膜上皮发育为主,且在整个发育过程中也均未观察到POV结构。通过免疫组化染色观察,发现LSCs标志物在发育过程中呈动态表达,按照其在发育过程中CECs表达减弱的时间先后顺序排序如下:Vim>p63>CK15>CK14,说明LSCs标志物的表达具有时间特性,其中Vim的表达仅在E19之前可在小鼠眼角膜的上皮细胞膜上被检测到,CK15的表达在P14之后仅在LSCs可被检测到,而p63和CK14则在CECs持续低表达,说明CK15更适合作为P14后LSCs的标志物。我们进一步利用转录组测序和蛋白质组测序进行LSCs标志物的研究。采用Illumina Hiseq Xten对4周龄小鼠角膜及角膜缘组织进行转录组测序,利用qRTPCR验证测序分析结果可靠（相关系数为0.7598）,通过差异分析获得1907和395个在角膜缘中分别显著性上调和下调的基因。发现显著上调基因的GO条目与离子转运,组织发育调节,视觉感知和细胞粘附等有关,富集到的KEGG通路中ECM-受体相互作用、PI3K-AKT、MAPK通路参与LSCs干性的维持。我们还利用Label-free LC-MS/MS进行蛋白组学的分析,并通过免疫印迹试验验证测序分析结果可靠。通过差异分析获得804和76个分别在角膜缘中显著性上调和下调的蛋白,基于这些差异表达的蛋白进行免疫组化染色和功能注释。通过免疫组化染色,我们发现3个新的LSCs候选标志物,即ALDH3B2、SLC5A8和HSD17B2。通过基于显著上调蛋白的功能注释分析,发现细胞粘附蛋白和Focal粘附通路对LSCs干性表型的维持具有重要的作用。最后,将转录组和蛋白质组数据进行关联分析,获得相对于角膜组织而言,在角膜缘组织的转录水平和蛋白质水平中表达趋势一致的DEGs和DEPs,其相关性为0.7357（斯皮尔曼系数）。然后利用这些表达趋势一致的DEGs和DEPs进行生物信息学分析,发现细胞的外泌体参与CECs和LSCs的信息交流,且在LSCs niche中,细胞外基质蛋白可能作为关键性节点蛋白通过激活Focal粘附、ECM-受体相互作用、PI3K-AKT通路对LSCs的细胞周期、增殖、分化、迁移和存活等多种干性相关表型的维持具有重要作用。综上所述,本研究首次揭示了小鼠LSCs标志物表达的时间光谱,证明了标志物在LSCs表达所特有的时间性。在未能确定持续性的LSCs特异性标志物的情况下,可以根据不同的生理年龄选择相应的标志物识别LSCs。本研究并还首次基于转录组和蛋白质组测序分析,发现了三个新的LSCs候选标志物及其干性相关通路。这些发现为LSCs的识别、分离及其干性的维持提供不同层面的实验数据,为探究LSCs niche内单细胞之间的异质性奠定基础。
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摘要abstract主要符号对照表第1章 引言 1.1 角膜上皮的动态稳定 1.1.1 角膜的组织学结构和功能 1.1.2 X/Y/Z假说 1.2 LSCs及其niche 1.2.1 LSCs的生物学特征 1.2.2 LSC niche的结构 1.2.3 LSCs niche的组成 1.3 LSCs标志物研究现状 1.3.1 细胞周期调控蛋白 1.3.2 ATP结合转运蛋白 1.3.3 细胞骨架蛋白 1.3.4 分化相关蛋白 1.4 LSCs的识别 1.4.1 LSCs标记物共表达 1.4.2 细胞核质比大于0.7（N/C≥0.7） 1.4.3 标签滞留 1.4.4 侧群现象 1.5 LSCs特异性标志物研究的难点 1.5.1 角膜缘组织学的特殊性 1.5.2 酶消化的影响 1.5.3 缺乏理想的LSCs分离技术 1.5.4 LSCs的时间和空间分布的影响 1.6 新一代测序技术应用于LSCs标志物的研究 1.6.1 转录组测序在LSCs标志物的研究 1.6.2 蛋白质组测序在LSCs标志物的研究 1.7 本课题的来源与研究意义 1.8 本课题的研究思路及主要研究内容第2章 小鼠角膜缘干细胞表达特点的研究 2.1 实验材料 2.1.1 实验动物 2.1.2 实验试剂 2.1.3 实验仪器 2.2 实验方法 2.2.1 组织收集 2.2.2 石蜡切片制备 2.2.3 HE染色 2.2.4 免疫组化染色 2.3 实验结果 2.3.1 小鼠眼球角膜的组织学结构 2.3.2 LSCs标志物在小鼠眼球表面的空间表达分布 2.4 分析与讨论 2.4.1 小鼠LSCs具有独特的niche结构 2.4.2 4周龄小鼠LSCs的表达模式不同 2.5 小结第3章 小鼠角膜缘干细胞的基因表达与发育相关性的研究 3.1 实验材料 3.1.1 实验动物 3.1.2 实验试剂及耗材 3.1.3 实验仪器 3.2 实验方法 3.2.1 组织收集 3.2.2 蜡切片制备 3.2.3 HE染色 3.2.4 免疫组化染色 3.3 实验结果 3.3.1 小鼠眼角膜的发育 3.3.2 小鼠LSCs标志物的表达与发育相关 3.4 分析与讨论 3.4.1 光刺激促进小鼠角膜上皮的发育 3.4.2 LSCs的表达具有时间特性 3.5 小结第4章 基于Illumina平台的小鼠角膜缘干细胞干性相关基因的转录组学研究 4.1 实验材料 4.1.1 实验动物 4.1.2 实验试剂和耗材 4.1.3 实验仪器 4.2 实验方法 4.2.1 组织收集 4.2.2 总RNA提取 4.2.3 文库制备以及Illumina Hiseq Xten测序 4.2.4 转录组学序列的分析 4.2.5 基因的表达以及功能分析 4.2.6 qRT-PCR 4.2.7 免疫组化染色 4.3 实验结果 4.3.1 转录组学测序概述 4.3.2 样品间基因表达相关性 4.3.3 DEGs的识别 4.3.4 DEGs的 GO分析 4.3.5 DEGs的 KEGG通路富集 4.3.6 DEGs的 qRT-PCR验证 4.3.7 细胞表面标志物的免疫组化染色 4.4 分析与讨论 4.4.1 潜在的LSCs标志物表达的模式 4.4.2 在LSCs中富集到的与发育和细胞命运相关的GO条目 4.4.3 ECM相关的信号通路维持LSCs的表型 4.4.4 LSCs的基因表达模式与细胞间交流有关 4.5 小结第5章 基于Label-Free LC-MS/MS的小鼠的角膜缘干细胞标志物的研究 5.1 实验材料 5.1.1 实验动物 5.1.2 实验试剂和耗材 5.1.3 实验仪器 5.2 实验方法 5.2.1 组织收集 5.2.2 总蛋白提取和肽段酶解 5.2.3 质谱分析和LC-MS/MS数据采集 5.2.4 DEPs的生物信息学分析 5.2.5 免疫印迹检测（WB） 5.2.6 免疫组化染色 5.3 实验结果 5.3.1 质量控制以及鉴定蛋白质和肽段的特性 5.3.2 DEPs的识别 5.3.3 DEPs的 GO分析 5.3.4 DEPs的 KEGG通路富集 5.3.5 免疫组化染色检测候选LSCs标志物 5.3.6 DEPs的验证 5.4 分析与讨论 5.4.1 ALDH3B2、SLC5A8和HSD17B2 可作为候选LSCs标志物 5.4.2 细胞粘附蛋白维持LSCs表型及其niche细胞间的联系 5.4.3 Focal粘附信号通路调控LSCs增殖和自我更新 5.5 小结第6章 联合转录组学和蛋白质组学分析小鼠角膜缘干细胞干性相关通路 6.1 实验材料 6.2 实验方法 6.2.1 技术路线 6.2.2 关联数量及其表达量相关性统计分析 6.2.3 表达趋势相同的DEGs和 DEPs的生物信息学分析 6.3 实验结果 6.3.1 关联数量统计 6.3.2 表达量相关性分析 6.3.3 关联到的表达趋势一致的DEPs的蛋白互作网络分析 6.3.4 关联到的表达趋势一致的DEPs的GO分析 6.3.5 关联到的表达趋势一致的DEPs的KEGG分析 6.4 分析与讨论 6.4.1 细胞外外泌体参与CECs-LSCs的交流 6.4.2 Focal粘附、ECM-受体相互作用和PI3K-AKT通路维持LSCs干性表型 6.5 小结第7章 总结与展望 7.1 总结 7.2 展望参考文献致谢附录 A附录 B个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果
文章来源
类型: 博士论文
作者: 郭志侯
导师: 林俊生,邱建龙
关键词: 角膜缘干细胞,角膜缘干细胞标志物,转录组学,蛋白质组学
来源: 华侨大学
年度: 2019
分类: 基础科学,医药卫生科技
专业: 生物学,基础医学
单位: 华侨大学
分类号: R329.2
总页数: 178
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标签：角膜缘干细胞论文; 角膜缘干细胞标志物论文; 转录组学论文; 蛋白质组学论文;
