李雪1漆兆李1尹铭2（1大英县疾病预防控制中心629300；2大英县人民医院629300）
【摘要】目的比较4种不同的痰内结核分枝杆菌的检测方法灵敏度，以寻找一种更准确、快速的检测结核分枝杆菌的方法。方法收集112例县人民医院2010年2月-2011年4月期间确诊为肺结核的患者痰标本，分别采用罗氏培养法、涂片法、免疫磁珠分离（IMS）-涂片、免疫磁珠分离（IMS）-PCR法对结核分枝杆菌进行检测，比较4种检测方法的敏感度。结果IMS-PCR法对结核分枝杆菌的敏感度最高，为71.4％,罗氏培养法为68.2%，两者无明显差异（P>0.05）；IMS-涂片法检测敏感度为28.6%，涂片法最低，仅21.4%，两者均明显低于IMS-PCR法（P<0.01），具有统计学意义。结论IMS-PCR法可快速、准确检测痰内结核分枝杆菌，对肺结核患者早期诊断具有重要意义。
【关键词】结核分枝杆菌免疫磁珠分离罗氏培养法PCR涂片法
肺结核是我国严重的公共卫生问题，其具有传播广、早期症状少、疫苗免疫效果不佳等特点，检出痰中含有结核分歧杆菌是临床诊断肺结核重要依据。然而，目前结核分枝杆菌感染的检测诊断虽有推荐标准，但最佳标准尚有待探讨。传统的痰中肺结核分枝杆菌的检测方法包括痰涂片和痰培养，但痰涂片的阳性率低，痰培养的周期太长，一般需要4-8周[1]，且阳性率也较低，给临床诊断带来一定的困难。PCR检测较传统的痰直接涂片和痰培养法敏感、更快速，但也存在假阳性、假阴性现象[2]。免疫磁珠分离技术(IMS)是近年快速发展的一种有效的免疫分离手段，其分离速度快、操作简单，目前已经广泛用于各种细胞的分离、核酸及蛋白质的纯化[3]。本研究拟通过比较IMS联合涂片，IMS联合PCR法，与传统的涂片法、罗氏培养法检测肺结核患者痰内结核分枝杆菌的灵敏度，寻找一种更准确、快速的检测结核分枝杆菌的方法。
1资料与方法
1.1一般资料
收集112例县人民医院2010年2月-2011年4月期间肺结核住院患者晨痰标本，其中男性87例，女性25例，年龄15-82岁，平均年龄55.64岁。所有病例均根据临床症状、痰涂片，结合胸部影像学检查或抗结核药物治疗而确诊为肺结核患者,所有病例接受抗结核药物治疗时间不超过1个月。
1.2诊断方法
1.2.1罗氏培养法
取肺结核患者的痰标本1-3ml置前处理管中，按照常规方法做罗氏结核分枝杆菌培养，观察满8周后，如发现疑似分枝杆菌生长的为阳性，如均未见菌落生长的则为阴性。
1.2.2涂片法患者
痰标本常规处理后，严格按照《结核病诊断细菌学检验规程》[4]操作，显微镜下观察结果，结果按《肺结核诊断标准》（WS288-2008）进行判定。
1.2.3IMS-涂片法
用兔抗H37Rv血清包被表面活化磁珠，然后往痰标本加入l-1.5倍消化剂进行液化处理，调节PH值至7-8，取lmL移入EP管，加入磁珠，混匀后进行磁性分离，收集磁珠，分离得到菌体，采用抗酸染色后镜检。
1.2.4IMS-PCR法
标本处理方法同1.3.3，磁性分离后收集磁珠，缓冲液洗涤2次后加入100μL无RNA水煮沸10min，取上清为模板;引物为结核分枝杆菌复合体重复序列IS6110保守区域，引物1（CGTGAGGGCATCGAGGTGGC）、引物2（GCGTAGGCGTCGGTGACAAA）由上海生工生物工程有限公司合成,扩增产物为245bp。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离,紫外灯下观察,于245bp处出现扩增条带者为阳性。
1.3统计学分析
采用SPSS16.0软件包进行统计分析，χ2检验比较4种检测方法的灵敏度,P<0.05为差异有显著性。
2结果
用罗氏培养法、涂片法、IMS-涂片法、IMS-PCR法对112例肺结核痰标本进行检验的结果见表1。由结果可见，IMS-PCR法对结核分枝杆菌的检出率最高，为71.4％,罗氏培养法检出率为68.2%，两者无明显差异（P>0.05）；IMS-涂片法检出率为28.6%，涂片法检出率最低，仅21.4%，两者均明显低于IMS-PCR（P<0.01），具有统计学意义。
表14种方法检测痰标本中肺结核分歧杆菌结果
3讨论
肺结核是严重威胁人类健康的慢性传染病,我国是全球22个肺结核高发的国家之一。及早诊断并治疗是目前控制肺结核传染的主要措施。长期以来，痰涂片抗酸染色镜检是检测结核分枝杆菌菌最常用的方法，优点是方便、快捷，但缺点是灵敏度较低。罗氏培养法灵敏度高于涂片法，但其耗时较长，同时其设备、试剂也比较昂贵。免疫磁珠分离技术与其他方法联合使用可以有效提高检测的灵敏度。研究表明，IMS-涂片法对痰中结核分枝杆菌的检出灵敏度较直接涂片法有所提高，而IMS-PCR检测灵敏度明显高于传统的培养法及涂片法。由此可见，免疫磁珠分离技术联合PCR方法具有现实的意义及应用前景，值得进一步深入研究。
参考文献
[1]DenisA,Mitchison.TheDiagnosisandTherapyoftuberculosisDuringthePast100Years[J].AmJRespirCareMed.2005,171：699-706.
[2]徐宁.痰中结核杆菌的检测方法及临床意义[J].临床肺科杂志，2009,14（4）:536.
[3]郑玉群,许卫国,陆伟等.免疫磁珠分离涂片和PCR检测痰内结核分枝杆菌的诊断价值研究[J].江苏预防医学,2010,21(2):14-17.
[4]中国防痨协会.结核病诊断细菌学检验规程[J].中国防痨杂志,1996,18(1):28-31.