导读:本文包含了核酸疫苗疫苗论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:疫苗,核酸,佐剂,基因,免疫,抗原,蛋白。
核酸疫苗疫苗论文文献综述
赖为民,汪开毓,魏文燕,杨蕊菡,耿毅[1]（2019）在《牛脾转移因子联合核酸疫苗对虹鳟鱼IHN病的保护率影响研究》一文中研究指出传染性造血器官坏死病(infectiou shematopoietic necrosis,IHN)是一种严重威胁鲑鳟的急性传染病。它主要感染鱼类的脾脏和肾脏等造血组织,引起组织坏死,根据鱼种、鱼龄、病毒菌株及饲养环境的不同,死亡率在80%～100%。目前,在多个国家和地区发现此病。一般认为眼球突出和拖假便是该病的典型特征。另外,稚鱼、幼鱼体侧以线状或v字型出血为特征。目前主要是通过严格的检疫制度和避(本文来源于《当代水产》期刊2019年06期）
庞洪泽[2]（2019）在《禽腺病毒4型核酸疫苗的构建及免疫效果初步评价》一文中研究指出禽腺病毒是一种对家禽危害极大的病原体,其中血清4型禽腺病毒(FAdV-4)主要引起禽的心包积水-包涵体肝炎综合征。该病发病快、死亡率高,目前预防该病主要靠灭活苗和弱毒苗,但是这两种疫苗存在很多的缺点,所以研发一种安全、高效的新型核酸疫苗对该病的防控很有帮助。本研究对其结构蛋白Hexon和Penton进行了串联,分别进行了原核表达和真核表达,获得了Hexon-Penton串联蛋白,对其免疫效果进行了初步研究,其结果如下:1.禽腺病毒血清4型Hexon-Penton串联蛋白的原核表达及多抗制备本研究根据NCBI GenBank中公布的Hexon基因和Penton基因序列设计引物,克隆出Hexon基因和Penton基因并串联,得到Hexon-Penton(HP)串联基因,将HP基因导入表达载体pET32a(+),获得重组质粒pET32a-HP,将其转化表达菌株BL21经IPTG诱导表达,得到分子质量约为108kDa的HP原核蛋白,HP原核蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠制备多抗血清,说明HP原核蛋白具有良好的免疫原性,为进一步建立FAdV-4的血清学检测方法奠定了基础。2.禽腺病毒血清4型Hexon-Penton串联蛋白的真核表达与分析为了获得293T细胞表达的FAdV-4 HP串联蛋白,本研究将FAdV-4 HP串联基因导入表达质粒pcDNA3.1(+),获得重组质粒pcDNA3.1-HP,转染293T细胞,获得HP真核蛋白,经间接免疫荧光试验(IFA)和Western Blot鉴定。真核蛋白免疫印迹分析和IFA鉴定表明,HP真核蛋白可与多抗血清发生特异性反应,蛋白质分子质量约为90kDa,HP真核蛋白在293T细胞中获得了良好表达。本研究构建了重组质粒pcDNA3.1-HP,并在真核细胞中获得表达,为进一步研制FAdV-4核酸疫苗奠定了基础。3.核酸疫苗免疫效果初步研究本研究制备了FAdV-4 HP串联基因核酸疫苗,使用不同的剂量免疫雏鸡。对雏鸡产生的抗体进行了免疫原性与效价检测,结果表明,该疫苗免疫雏鸡后在雏鸡体内传产生了特异性抗体,抗体水平在免疫后21天达到最高,免疫剂量为100μg效果较好。(本文来源于《河北科技师范学院》期刊2019-06-01）
张涵[3]（2019）在《美洲型PRRSV二价核酸疫苗的制备及小鼠的免疫研究》一文中研究指出猪繁殖与呼吸综合征(Procine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS 最早于1987年在美国报道,自爆发以来,给养猪业造成了严重的经济损失。在1995年左右传入中国,引起该病的的病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(Procine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)。我国流行的主要是美洲型PRRSV及其变异株,近些年来我国PRRSV谱系呈多样化趋势,增加了我国对PRRS的预防和治疗的难度。JXA1-like谱系毒株是PRRS爆发以来比较流行的高致病性PRRSV(HP-PRRSV),而NADC30-like谱系毒株是近些年流行的HP-PRRSV。通过这两个谱系构建的二价核酸疫苗将是一种非常理想的防控PRRSV的新型疫苗。从某发病猪场采集样本采集到一株PRRSV将其命名为YN-L株。对其进行全基因扩增,然后对其Nsp2、GP5基因和全基因组进行遗传进化分析及同源性比对,并对其Nsp2、GP5基因编码的氨基酸的序列进行比对,证实该YN-L株为JX41-like谱系毒株。对YN-L毒株的理化特性进行研究,结果表明,YN-LQ毒株不耐热、不耐酸和碱,对乙醚、氯仿和紫外线敏感,对胰蛋白酶和超声波不敏感。将YN-LQ株的ORF5基因与NADC30-Lie的ORF5基因通过自裂解Linker进行连接,再与pVAX1载体连接构建二价核酸疫苗,转染至BHK细胞,用蛋白免疫印迹(Western Blot)等方法进行验证。结果显示,二价核酸疫苗可表达GP5(JXA1-Like)-Linker-GP5(NADC30-Like)目的蛋白。将所构建的二价核酸疫苗进行小鼠免疫研究,实验结果显示,二价核酸疫苗加佐剂组可提高小鼠的体液免疫和细胞免疫,具有较好的免疫原性。IL-4和IFN-γ细胞因子检测显示免疫35d时,二价核酸疫苗加佐剂组均高于二价核酸疫苗组。中和抗体检测显示免疫35d时,二价核酸疫苗加佐剂组高于其它组,中和抗体滴度最高达1:17.77。CD3~+CD4~+和CD3~+CD8~+血清细胞因子检测结果显示35d时,二价核酸疫苗加佐剂组均高于二价核酸疫苗组。T淋巴细胞增殖实验结果显示:特异性刺激组的刺激指数(SI)高于非特异性刺激组,二价核酸疫苗加佐剂组和二价核酸疫苗组高于其它组。在特异性刺激中,二价核酸苗加佐剂组高于二价核酸疫苗组;在非特异性刺激中,二价核酸疫苗加佐剂组也高于二价核酸疫苗组。综上,联合佐剂可提高二价核酸疫苗的免疫效果,为美洲型PRRSV疫苗的进一步研发奠定基础。(本文来源于《延边大学》期刊2019-05-28）
何琦瑶,魏文燕,汪开毓,刘家星[4]（2019）在《传染性造血器官坏死病毒表面糖蛋白基因核酸疫苗的构建及对虹鳟血液生化指标的影响》一文中研究指出为研究传染性造血器官坏死病毒(infectious hematopoietic necrosis virus, IHNV)表面糖蛋白(glycoprotein, G)基因核酸疫苗对虹鳟免疫保护效果及血液生化指标的影响,将IHNV G基因克隆至pMD19-T载体中,连接产物在DH5α中进行转化,获取重组质粒pMD19-TG后回收G基因片段。将鉴定正确的G基因片段利用Bam H I和Xho I酶切位点克隆在真核表达载体pVAX1上,构建核酸疫苗pVAX1-G。重组质粒pVAX1-G按照8μg/尾的剂量注射虹鳟设为pVAX1-G组,同时设8μg/尾空质粒组、PBS对照组和空白组,于免疫后21 d,以100倍半数组织培养感染剂量(tissue culture infective dose, TCID50)通过腹腔注射的方式进行攻毒实验,计算核酸疫苗相对保护率(relative percent survival, RPS),攻毒后收集免疫虹鳟血清进行血液指标检测。结果显示,攻毒后虹鳟血清中16项指标中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)、总胆汁酸(TBA)、葡萄糖(GLU)、尿素(Urea)、肌酐(CREA)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)和球蛋白(GLO)与正常虹鳟相比有显着变化,空载组11项指标较pVAX1-G组变化显着;攻毒后14 d pVAX1-G组累积死亡率为19%(19/100),而空载组和PBS对照组分别为62%(62/100)和85%(85/100)。pVAX1-G核酸疫苗对虹鳟免疫保护率为78%。病理学观察发现,免疫pVAX1-G组虹鳟的肝脏、脾脏、肾脏组织未见明显损伤。综上表明,pVAX1-G作为核酸疫苗有助于减轻IHNV对虹鳟的损伤,对IHNV有较好的免疫保护效果。(本文来源于《水产学报》期刊2019年08期）
宋丽,熊丹,焦新安,潘志明[5]（2019）在《聚乙烯亚胺作为核酸疫苗佐剂的研究进展》一文中研究指出疫苗是防控病原感染的最有效方式之一,通常需要添加佐剂才能确保其高效的免疫应答。聚乙烯亚胺(polyethyleneimine, PEI)是一种被广泛研究的阳离子聚合物,其传统用途是作为核酸转染试剂或DNA疫苗运载工具。近年来越来越多的研究表明PEI也能作为一种佐剂。本文回顾了PEI的理化性质及其在不同领域的应用,阐述了PEI具有免疫活化功能的细胞和分子机制。另外,本文总结了PEI作为疫苗佐剂在体内和临床试验中的应用,并讨论了其在未来应用中的前景和挑战。(本文来源于《中国人兽共患病学报》期刊2019年07期）
徐焘杰,李元凯,林霞琳,黄志坚,殷光文[6]（2019）在《分子佐剂Ov-ASP-1对弓形虫SAG1核酸疫苗的影响》一文中研究指出为了研究分子佐剂Ov-ASP-1对弓形虫表面抗原糖蛋白1(SAG1)核酸疫苗的免疫效力的影响,用含有分子佐剂Ov-ASP-1的pVAX1-Ov-ASP-1-SAG1质粒、对照质粒pVAX1-SAG1、空载体pVAX1免疫鸡,并设置PBS对照组,通过抗体水平与细胞因子水平的检测结果判断免疫效果和免疫应答情况;然后用弓形虫RH株人工感染试验鸡,通过实时荧光定量PCR检测鸡的肺脏、脾脏、肝脏中的弓形虫数量,判断分子佐剂Ov-ASP-1是否增强鸡对弓形虫的抵抗力。结果表明:与其他组相比,试验各阶段pVAX1-Ov-ASP-1-SAG1组免疫球蛋白G(IgG)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-12(IL-12)和干扰素γ(IFN-γ)水平都较高,差异达到了显着或极显着水平(P<0.05或P<0.01);攻虫后pVAX1-Ov-ASP-1-SAG1组感染弓形虫的鸡荷虫量比其他组极显着降低(P<0.01)。说明分子佐剂Ov-ASP-1可以显着增强弓形虫表面膜蛋白SAG1的免疫原性和免疫保护性。(本文来源于《黑龙江畜牧兽医》期刊2019年05期）
李训良[7]（2018）在《猪IL-12与TGEV S1核酸疫苗联合免疫保护效果研究》一文中研究指出猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)能够引发猪急性高度接触性的消化道传染病,即猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)。感染动物以呕吐、严重的腹泻、脱水为主要症状,而且经常同其他疾病混合发生,所有品种和年龄的猪对此病毒都易感,新生仔猪尤为严重,随着日龄的增大死亡率逐渐下降。猪传染性胃肠炎病毒包膜突起形状的S蛋白在病毒表面,介导粘合到宿主受体和膜融合,其可以分为S1和S2区域,S蛋白是病毒中和抗体产生的一个主要的靶点。自上世纪90年代以来,TGEV导致了全球性的严重的经济损失,一些疫苗制备技术被发展和商业化,目前国内主要为猪传染性胃肠炎病毒-猪轮状病毒-猪流行性腹泻病毒叁价弱毒疫苗,但存在免疫效果不确实和返祖等缺陷,故TGEV新型高效疫苗研究尤为迫切,其中以新型基因工程疫苗的研究和开发为热点。猪白细胞介素12(Porcine interleukin 12,pIL-12)是一种重要的多功能免疫调节细胞因子,IL-12能诱导干扰素γ(Interferonγ,IFN-γ)产生并且引发CD4~+T细胞分化为Th1(T辅助细胞)型细胞,IL-12有多种重要的生物学功能,它关系到早期非特异性的先天免疫和之后的特异性抗原获得性免疫,可作为免疫佐剂提高疫苗的免疫保护效果。本研究对辽宁省抚顺市60个规模猪场进行了TGEV感染分布情况的调查,对有腹泻症状的仔猪共采集了300份样品,通过RT-PCR方法对TGEV的感染情况进行了调查,并对TGEV关键基因S基因进行了生物信息学分析。通过分子生物学技术利用pVAX1载体,分别构建了TGEV Purdue 46毒株S1基因和猪IL-12基因的真核表达质粒pVAX1-TGEV-S1和pVAX1-pIL-12-(p40)-(p35)。利用脂质体转染技术将两种质粒转入BHK细胞中,通过免疫荧光试验检测其蛋白表达。选取20头7日龄无TGEV病原感染和抗体的仔猪随机分成5组,分别是pIL-12+TGEV-S1组、TGEV-S1组、pIL-12组、pVAX1组、空白组,从7日龄开始,用重组真核表达质粒pVAX1-TGEV-S1和pVAX1-pIL-12-(p40)-(p35)免疫,每次免疫间隔14天,共免疫3次,每间隔7天采集血液样品,并于第叁次免疫后7天进行攻毒,攻毒后5天捕杀猪只并采集血液及组织学样品。采集样品通过淋巴细胞增殖试验、流式细胞检测技术、酶联免疫吸附试验、病毒中和试验、组织冰冻切片荧光检测和HE染色等方法,分别对不同组别及不同日龄仔猪样品进行了细胞免疫和体液免疫及免疫保护相关指标的检测。试验结果表明,辽宁省抚顺市60个规模猪场的300份样品,共检测出阳性样品3份,通过对S基因的克隆测序、结构分析、序列同源性分析、系统进化树分析和蛋白结构分析,与其他17个参考毒株的S基因相比较,有5处核苷酸的变异,造成了4处氨基酸的变化,有1处氨基酸的变化导致了蛋白质二级结构的改变,与WH1、Almazan毒株S基因的同源性和亲源性最高,属于Purdue毒株分支,与目前普遍流行的毒株相近。试验构建了TGEV Purdue 46毒株S1基因和猪IL-12基因的真核表达质粒pVAX1-TGEV-S1和pVAX1-pIL-12-(p40)-(p35),将两种质粒转染BHK细胞后,所表达的蛋白通过免疫荧光试验都能够被其特异性多克隆抗体检测到明显的荧光信号。动物免疫保护试验,TGEV-S1组和pIL-12+TGEV-S1两种重组表达质粒的免疫组,在不同的免疫指标检测中,有不同程度的升高,相比较于空白组和pVAX1组有明显的差异,其中pIL-12+TGEV-S1组的结果尤为显着。在淋巴细胞增殖试验、TGEV S1特异性IgG抗体检测、TGEV中和抗体检测中,TGEV-S1组和pIL-12+TGEV-S1组有明显升高,其中pIL-12+TGEV-S1组尤为明显,与TGEV-S1组相比较差异显着(p<0.05),与空白组、pVAX1组、pIL-12组相比较差异极显着(p<0.01)。在CD4~+T淋巴细胞检测、CD8~+T淋巴细胞检测、IFN-γ细胞因子检测、细胞毒性T淋巴细胞检测中,pIL-12组、TGEV-S1组和pIL-12+TGEV-S1组都有明显升高,其中pIL-12+TGEV-S1组尤为明显,与空白组、pVAX1组相比较差异极显着(p<0.01)。肠道组织病毒分布的免疫荧光检测和病理组织学检查表明,TGEV-S1组和对照组之间差异明显,其中pIL-12+TGEV-S1联合免疫组病毒含量更少,组织损伤更轻。说明pIL-12作为免疫佐剂在仔猪机体免疫应答方面有辅助增强的作用,能够提高pVAX1-TGEV-S1真核表达质粒的免疫保护效果。本研究首次将TGEV S1基因与pIL-12基因的重组真核表达质粒共同免疫仔猪,观察仔猪免疫应答水平及免疫保护效果,结果显示佐剂pIL-12与TGEV S1抗原基因的联合使用,能够明显的促进机体的细胞免疫应答,也能够在体液免疫应答中发挥一定作用,从而提高机体免疫水平对抗病毒感染。为新型核酸疫苗和细胞因子免疫佐剂免疫作用和免疫机理的深入研究进一步提供理论依据。(本文来源于《东北农业大学》期刊2018-12-01）
赵臣,王婉莹,赵佳琪,刘爽,王丽[8]（2018）在《核酸疫苗p EGFPN1-MLAA34-B7H4IgV的构建及其免疫活性观察》一文中研究指出目的构建p EGFPN1-MLAA34-B7H4IgV核酸疫苗,并检测其免疫活性,探讨核酸疫苗抗白血病效应。方法采用重迭延伸PCR技术扩增急性白血病相关抗原基因MLAA34和负性共刺激分子B7H4的融合基因(MLAA34-B7H4IgV),并构建核酸疫苗p EGFPN1-MLAA34-B7H4IgV。将28只BALB/c小鼠随机分为P、M、B、MB组各7只,分别在小鼠两侧股四头肌内侧肌内注射磷酸盐缓冲液p EGFPN1、p EGFPN1-MLAA34、p EGFPN1-B7H4IgV、p EGFPN1-MLAA34-B7H4IgV质粒100μg,在0、2、4周各行1次同剂量加强免疫;分别于0、4、8周眼球取血,8周取血后处死小鼠并摘取脾脏。ELISA法检测免疫8周血清中抗体Ig G1、Ig G2a以及免疫0、4、8周血清细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ,MMT法检测小鼠脾淋巴细胞对单核巨噬细胞THP-1的增殖抑制作用。结果 MLAA34-B7H4IgV融合基因PCR产物电泳检测约为2 000 bp,与理论值(1 922 bp)相符; p EGFPN1-MLAA34-B7H4IgV酶切后电泳检测为5 000~7 500 bp,与理论值(6 655 bp)相符。与同组免疫0周时、同时点P组比较,免疫4、8周时M、B、MB组血清细胞因子IL-2、IL-4水平升高而IFN-γ水平降低(P均<0. 05或<0. 01)。与同时点M、B组比较,MB组血清细胞因子IL-2、IL-4水平升高而IFN-γ水平降低(P均<0. 05); M、B组同时点比较,差异无统计学意义。免疫8周,MB组血清Ig G1水平高于其他各组(P均<0. 05),其他各组间差异均无统计学意义(P均> 0. 05);各组血清Ig G2a水平差异均无统计学意义(P均> 0. 05)。MB组THP-1细胞增殖抑制率高于同效靶比其他各组(P均<0. 05或<0. 01);效靶比为50∶1和25∶1时,M组和B组THP-1细胞增殖抑制率高于高于P组(P均<0. 05),两组之间无差异;效靶比为12. 5∶1时,B组THP-1细胞增殖抑制率高于M组、P组(P均<0. 05)。结论成功构建了核酸疫苗p EGFPN1-MLAA34-B7H4IgV,该疫苗激活了小鼠体内的细胞免疫和体液免疫,具有明显的抗白血病效应。(本文来源于《山东医药》期刊2018年42期）
张贺,翟少伦,罗满林,吕殿红,温肖会[9]（2018）在《虎源犬瘟热病毒核酸疫苗构建及免疫原性初步研究》一文中研究指出为了研究虎源犬瘟热病毒(CDV)主要保护性抗原基因(H基因和F基因)的免疫原性,参照GenBank上发表的CDV基因全长序列(KP793921)设计了两对引物,特异性扩增CDV的F和H基因,利用pcDNA3. 1(+)真核表达载体构建了CDV核酸疫苗(质粒pcDNA3. 1-F和pcDNA3. 1-H),通过脂质体介导法将这两种真核表达质粒分别转染BHK-21细胞,通过RT-PCR、间接免疫荧光和Western-blot检测重组质粒在体外细胞的表达情况;通过肌肉免疫Balb/c小鼠,检测重组质粒在体内的表达情况。结果表明:真核表达载体pcDNA3. 1-F和pcDNA3. 1-H被成功构建,F、H蛋白均具有免疫原性,但诱导抗体效价不高,有待进一步研究改善。说明pcDNA3. 1-F和pcDNA3. 1-H重组疫苗可以诱导产生抗CDV的中和抗体,但是抗体效价较低,需要进一步试验分析解决。(本文来源于《黑龙江畜牧兽医》期刊2018年21期）
陈博[10]（2018）在《布鲁斯菌BvrR基因核酸疫苗的构建及免疫效果研究》一文中研究指出目的:布鲁斯菌(Brucella)是引起布鲁斯菌病(Brucellosis)的病原体。布鲁斯菌病可以引起人类的波状热,牛、羊、猪等家畜的流产。布鲁斯菌可分为六个种,即马耳他布鲁斯菌、流产布鲁斯菌、猪布鲁斯菌、绵羊布鲁斯菌、犬布鲁斯菌和沙林鼠布鲁斯菌。布鲁斯菌病是世界范围内较严重的人畜共患传染病之一,在我国北方地区内蒙古、山西、吉林、黑龙江、河北、宁夏等省区流行较广,布鲁斯菌病已经成为最严重的公共卫生问题之一。目前,对动物布鲁斯菌病的防治,依据各地区实际状况的不同,主要是采用疫苗免疫接种或检疫、扑杀的方法。迄今为止已有几种较成功的布鲁斯菌减毒疫苗应用于生产,国外使用的主要有牛种布鲁斯菌19(B.abortus strain 19,S19)疫苗、羊种布鲁斯菌Rev.1(B.melitensis Rev.1)疫苗、牛种布鲁斯菌45/20(B.abortus strain 45/20)疫苗和粗糙型牛种布鲁斯菌51(Rough strain B.abortus 51,RB51)疫苗。我国主要使用的是猪种布鲁斯菌S2(B.suis strain2,S2)疫苗。虽然这些减毒疫苗在布鲁斯菌病的防治上起到了积极的作用,但它们有的毒力较强,在推荐剂量使用时对于妊娠动物还存在流产的可能,对人类来说并不安全,存在着潜在感染人类的可能性,有的免疫保护率低,不能供人类应用。因此有必要研制和开发新型布鲁斯菌疫苗。因为布鲁斯菌是一种可以在细胞内寄生并造成感染的病原微生物,因此可以引起机体强烈的细胞免疫应答,在对抗细胞内寄生菌感染方面极具潜力的核酸疫苗就成为了人们关注的研究热点。核酸疫苗与常规疫苗相比除了在预防细胞内寄生菌感染方面效果较好外,还具有无感染风险、可激发长期的免疫应答、比减毒疫苗具有更高的稳定性并且易于制备、造价低等优点。现在已有核酸疫苗用于预防人和动物的多种病毒、真菌和寄生虫感染的报道。在布鲁斯菌核酸疫苗的研究报道中,除了用布鲁斯菌外膜蛋白基因构建的核酸疫苗外,还有一些用布鲁斯菌胞内蛋白基因构建核酸疫苗的报道。据报道,布鲁斯菌胞内蛋白如:L7/L12核糖体蛋白、Cu/Zn超氧化物歧化酶等基因皆可作为布鲁斯菌核酸疫苗的候选基因并取得了较好的免疫效果。这说明,布鲁斯菌的胞内蛋白基因也可以作为核酸疫苗的候选基因。布鲁斯菌BvrR/BvrS双组分系统是调节布鲁斯菌感知系统的蛋白,在不同种属的布鲁斯菌中具有很高的同源性。据报道,布鲁斯菌BvrR/BvrS缺失突变株表现出侵入细胞的能力减弱,不能抵抗溶酶体的消化作用,在细胞内的复制能力也减弱。更进一步的研究还发现,BvrR/BvrS的缺失使布鲁斯菌失掉对细胞杀菌多聚阳离子的抵抗作用,可增加布鲁斯菌细胞膜表面对表面活性剂的通透性。因此,BvrR/BvrS双组分系统与布鲁斯菌的毒力有关。鉴于该组蛋白在细胞内较保守不宜变异,不同种属的布鲁斯菌BvrR/BvrS基因具有高度同源性,如果该调节蛋白具有特异的免疫原性则可作为布鲁斯菌的核酸疫苗,使用这一种疫苗可预防多种属布鲁斯菌的感染,在布鲁斯菌病的特异性预防领域会有重要意义。本研究拟采用布鲁斯菌BvrR/BvrS双组分系统中的BvrR基因作为靶基因,插入真核表达载体pcDNA3.1中构建新型核酸疫苗pcDNA-BvrR,然后转染Vero细胞分析其在细胞内的瞬时表达情况。随后将重组真核表达质粒pcDNA-BvrR免疫BALB/c小鼠来探讨BvrR基因核酸疫苗的免疫效果。这些研究为进一步探讨布鲁斯菌BvrR基因核酸疫苗的免疫机理以及保护效果提供依据。利用BvrR基因在布鲁斯菌种属之间具有高度同源性的特点,用一种核酸疫苗将可以预防多种属布鲁斯菌的感染。研究方法:1、BvrR基因的PCR扩增。获取PCR扩增模板,20μL反应体系中用引物P1、P2进行PCR扩增。反应结束后取10μL反应液进行琼脂糖凝胶电泳,观察电泳结果。2、原核表达载体pET28a-BvrR的构建。BvrR基因与载体pET-28a连接。将连接产物转化BL21(DE3)感受态细胞,提取重组质粒pET28a-BvrR。3、原核表达载体pET28a-BvrR表达产物的Western blotting分析。转印后用封闭液浸泡转印膜,室温封闭1-2h,一抗室温孵育,二抗室温孵育,DAB显色。4、真核表达载体pcDNA-BvrR的构建。BvrR基因与载体pcDNA连接。将连接产物转化DH5α感受态细胞,提取重组质粒pcDNA-BvrR。5、真核表达载体pcDNA-BvrR表达产物的RT-PCR及Western blotting分析。使用Simply P总RNA提取试剂盒提取总RNA,采用两步法试剂盒(宝生物公司)进行RT-PCR,按照厂家推荐步骤进行,以引物P2为特异引物进行反转录。反应结束后取10μL反应液进行琼脂糖凝胶电泳,观察电泳结果。制备凝胶板,进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳,根据凝胶面积按1-2 mA/cm~2,接通电源进行转印。转印后用封闭液浸泡转印膜,室温封闭1-2h,一抗室温孵育,二抗室温孵育,DAB显色。6、pcDNA-BvrR核酸疫苗免疫BALB/c小鼠。pcDNA-BvrR免疫组、pcDNA3.1对照组分别于后肢腿部胫前肌注射浓度为1μg/μL的pcDNA-BvrR质粒和pcDNA3.1质粒,每只小鼠注射100μg质粒。PBS对照组注射PBS 100μL间隔2周后再次注射,共免疫3次。7、ELISA方法检测小鼠血清特异性抗体及细胞因子。采用ELISA方法检测小鼠血清中特异性抗体及抗体亚类IgG1和IgG2a的水平,检测小鼠血清中IFN-?、IL-4的含量,以确定pcDNA-BvrR核酸疫苗的免疫效果。8、MTT法检测小鼠脾脏淋巴细胞增殖。9、流式细胞仪检测小鼠T细胞亚类(CD4~+、CD8~+)。10、攻毒保护试验确定疫苗保护率。将第3次免疫后一周的pcDNA-BvrR免疫组、pcDNA对照组小鼠后肢胫前肌注射100μL浓度为2×10~6活菌/μL的布鲁斯菌S19株。在注射布鲁斯菌S19株后第14天后进行无菌取脾脏,平皿中放2ml灭菌生理盐水,将脾脏研磨均匀,接种到布鲁斯菌选择性培养基,37℃,5%CO_2培养,计算菌落数。结果:1、采用PCR方法扩增了BvrR基因。2、构建了原核表达载体pET28a-BvrR,表达产物经SDS-PAGE电泳检测及Western blotting分析为BvrR融合蛋白。纯化的BvrR蛋白与布鲁斯菌多克隆抗体之间具有免疫反应性。3、构建了真核表达载体pcDNA-BvrR,经RT-PCR及Western blotting鉴定,真核表达载体pcDNA-BvrR可以在真核细胞中表达。4、布鲁斯菌核酸疫苗pcDNA-BvrR可以刺激小鼠产生特异性IgG抗体。5、布鲁斯菌核酸疫苗pcDNA-BvrR可以增强小鼠IFN-?的分泌,刺激小鼠淋巴细胞的增殖,使脾细胞中CD4~+和CD8~+T细胞亚类数量显着增多。6、布鲁斯菌核酸疫苗pcDNA-BvrR激发机体的免疫应答以Th-1型免疫应答为主。结论:1、原核表达的BvrR蛋白与布鲁斯菌多克隆抗体之间具有免疫反应性。2、布鲁斯菌核酸疫苗pcDNA-BvrR可以刺激小鼠产生特异性IgG抗体,激发机体的免疫应答以Th-1型免疫应答为主。3、布鲁斯菌核酸疫苗pcDNA-BvrR产生了一定的免疫保护性。(本文来源于《中国医科大学》期刊2018-10-01）
核酸疫苗疫苗论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
禽腺病毒是一种对家禽危害极大的病原体,其中血清4型禽腺病毒(FAdV-4)主要引起禽的心包积水-包涵体肝炎综合征。该病发病快、死亡率高,目前预防该病主要靠灭活苗和弱毒苗,但是这两种疫苗存在很多的缺点,所以研发一种安全、高效的新型核酸疫苗对该病的防控很有帮助。本研究对其结构蛋白Hexon和Penton进行了串联,分别进行了原核表达和真核表达,获得了Hexon-Penton串联蛋白,对其免疫效果进行了初步研究,其结果如下:1.禽腺病毒血清4型Hexon-Penton串联蛋白的原核表达及多抗制备本研究根据NCBI GenBank中公布的Hexon基因和Penton基因序列设计引物,克隆出Hexon基因和Penton基因并串联,得到Hexon-Penton(HP)串联基因,将HP基因导入表达载体pET32a(+),获得重组质粒pET32a-HP,将其转化表达菌株BL21经IPTG诱导表达,得到分子质量约为108kDa的HP原核蛋白,HP原核蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠制备多抗血清,说明HP原核蛋白具有良好的免疫原性,为进一步建立FAdV-4的血清学检测方法奠定了基础。2.禽腺病毒血清4型Hexon-Penton串联蛋白的真核表达与分析为了获得293T细胞表达的FAdV-4 HP串联蛋白,本研究将FAdV-4 HP串联基因导入表达质粒pcDNA3.1(+),获得重组质粒pcDNA3.1-HP,转染293T细胞,获得HP真核蛋白,经间接免疫荧光试验(IFA)和Western Blot鉴定。真核蛋白免疫印迹分析和IFA鉴定表明,HP真核蛋白可与多抗血清发生特异性反应,蛋白质分子质量约为90kDa,HP真核蛋白在293T细胞中获得了良好表达。本研究构建了重组质粒pcDNA3.1-HP,并在真核细胞中获得表达,为进一步研制FAdV-4核酸疫苗奠定了基础。3.核酸疫苗免疫效果初步研究本研究制备了FAdV-4 HP串联基因核酸疫苗,使用不同的剂量免疫雏鸡。对雏鸡产生的抗体进行了免疫原性与效价检测,结果表明,该疫苗免疫雏鸡后在雏鸡体内传产生了特异性抗体,抗体水平在免疫后21天达到最高,免疫剂量为100μg效果较好。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
核酸疫苗疫苗论文参考文献
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