双荧光素酶报告系统鉴定miR-204对水通道蛋白1基因的调控作用

论文摘要

[目的]构建水通道蛋白1（AQP1）基因3’-UTR双荧光素酶报告载体,并验证miR-204与AQP1基因的靶向调控关系。[方法]采用生物信息学软件预测miR-204与AQP1基因的结合位点;荧光定量PCR法（qRT-PCR）检测转染miR-204抑制剂前后miR-204及AQP1在K562细胞中的表达改变;构建AQP1-3’UTR野生型及突变型重组质粒,与miR-204、阴性对照共转染至293T细胞中,双荧光素酶报告系统检测各组荧光素酶活性。[结果]转染miR-204抑制剂后,miR-204表达量较阴性对照及空白对照组明显下降,分别为1. 97、9. 32、11. 25（P <0. 01）;而AQP1基因表达显著增高,分别为13. 14、2. 29、2. 54（P <0. 01）;酶切及测序结果表明已成功构建psi CHECKTM-2-AQP1 3’-UTR野生型和突变型重组质粒。荧光素酶活性结果表明,miR-204可使野生型AQP1 3’-UTR质粒荧光素酶活性降低约65. 9%,而对突变型质粒荧光素酶活性没有显著影响。[结论]成功构建了AQP1基因3’-UTR的荧光素酶报告基因载体,miR-204对AQP1存在靶向调控。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材料
•     1.1.1 实验材料
•     1.1.2 试剂
•     1.1.3 仪器
•   1.2 方法
•     1.2.1 生物信息学软件预测可能靶向AQP1的miRNA
•     1.2.2 qRT-PCR法检测K562细胞中miR-204与AQP1表达的关系
•     1.2.3 野生型与突变型AQP1双荧光素酶报告基因质粒的构建
•     1.2.4 双荧光素酶活性检测
•     1.2.5 统计学分析
• 2 结果与分析
•   2.1 miR-204与AQP1-3'UTR互补结合位点的预测
•   2.2 转染miR-204 inhibitor后K562细胞中miR-204与AQP1的表达改变
•   2.3 野生型和突变型重组质粒的构建与鉴定
•   2.4 双荧光素酶报告实验
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 危敏,余海浪,蔡翠霞,孟伟

关键词: 细胞,双荧光素酶报告系统

来源: 生物技术 2019年04期

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 深圳市南山区妇幼保健院检验科,南方医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室

基金: 国家自然科学基金项目(81672754,30901721),广东省自然科学基金项目(2015A030313249),广东省医学科研基金项目(A2017112),深圳市南山区科技计划项目(2017006)

分类号: Q78

DOI: 10.16519/j.cnki.1004-311x.2019.04.0055

页码: 324-329

总页数: 6

文件大小: 238K

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