基于PCR的两步法丝状真菌基因敲除方法

论文摘要

基因敲除是研究真菌基因功能的重要方法之一,目前,丝状真菌敲除多采用基因两侧的同源臂对基因组的靶标进行同源替换,然后采用抗生素对转化子进行筛选,但这存在着筛选效率低、假阳性率高、操作复杂等问题。本研究以稻瘟菌为研究对象,采取以下步骤对此进行优化:1)构建HPH-GFP（潮霉素-绿色荧光蛋白）融合表达载体; 2)分别用带有接头序列的引物克隆待敲除基因上、下游片段; 3)克隆上、下游片段与HPH-GFP组成嵌合体片段; 4)嵌合体片段转化真菌原生质体; 5)对敲除突变体进行筛选。结果表明,该法操作简便、高效,除了用潮霉素HPH作为筛选标记外,还可用GFP作为荧光筛选标记,极大提高了筛选效率,可用作丝状真菌基因功能研究。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 试验材料
•     1.1.1 供试菌株
•     1.1.2 供试试剂
•     1.1.3 培养基
•     1.1.4 实验设备
•   1.2 试验方法
•     1.2.1 稻瘟菌培养
•     1.2.2 PCR扩增、连接等分子生物学方法
•     1.2.3 稻瘟菌原生质体的制备及转化
•     1.2.4 稻瘟菌DNA的提取
•     1.2.5 引 物
• 2 结果与分析
•   2.1 第一轮PCR扩增
•   2.2 第二轮PCR扩增
•   2.3 稻瘟菌NACα基因敲除
•     1) 经过第一轮PCR分别扩增MoNACα基因上下游片段:
•     2) 第二轮PCR扩增形成MoNACα基因上下游片段与HPH-GFP的嵌合体:
•     3) 原生质体转化:
•   2.4 转化子鉴定
•     1) 转化子DNA的PCR验证:
•     2) 用荧光显微镜观察转化子是否有GFP荧光:
• 3 结论与讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 谢鑫,蒋君梅,王勇,任明见

关键词: 丝状真菌,基因敲除,稻瘟菌,扩增

来源: 种子 2019年04期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学

单位: 贵州大学农学院,国家小麦改良中心贵州分中心

基金: 国家科技支撑计划项目(2014 BAD 07 B 02),贵州省科技支撑(黔科合支撑[2019]2408号),贵州省科技厅工程中心建设计划项目(黔科合农G字[2012]4004号),贵州大学引进人才科研基金(贵大人基合字[2017]54号)

分类号: Q933

DOI: 10.16590/j.cnki.1001-4705.2019.04.015

页码: 15-19

总页数: 5

文件大小: 2001K

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