耐辐射奇球菌PprI的GAF结构域功能初探

论文摘要

耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans,DR）是一种具有极端抗性的微生物,对电离辐射（Ionizing radiation,IR）、紫外辐射、干旱、氧化胁迫和诱变剂等损伤因子均表现出极强的抗性,常作为研究DNA损伤修复的模式生物。耐辐射奇球菌的DNA损伤修复能力极强,这依赖于其高效的损伤修复途径。PprI蛋白被称为耐辐射奇球菌的辐射损伤响应开关,PprI-DdrO介导的DNA损伤响应途径与大肠杆菌中经典SOS响应机制有较大的差异,属于一种新型的损伤修复途径。而PprI作为这条途径的主角,发挥着至关重要的作用。PprI同源物IrrE的晶体结构已经解析,其中位于C端的GAF结构域功能尚未知晓。近年来的研究表明,GAF结构域主要在细胞内行使着信号分子受体的作用,说明其可能在PprI-DdrO介导的DNA损伤响应途径中发挥作用。以探究PprI的GAF结构域的功能为目的,开展了一系列研究,具体的实验结果如下:通过蛋白序列比对,揭示了 GAF结构域序列在同类菌株中具有同源性,通过解析PprI晶体结构并进行比对,进一步说明了 GAF结构域极为保守,研究这一结构域在奇球菌属中具有普适性;PprI是耐辐射奇球菌中响应损伤的关键蛋白,其主要包括:N端类锌指蛋白结构域、HTH结构域以及GAF结构域。敲除GAF结构域后,耐辐射奇球菌对UV和γ损伤的耐受性与野生型相比下降了两个数量级,几乎与PprI敲除株类似,表明GAF结构域对PprI完整功能至关重要;PprI可以通过切割转录抑制子DdrO,启动下游修复基因的表达。构建截短GAF结构域的PprI蛋白,以及GAF结构域蛋白,发现GAF结构域被截短后基本不会影响PprI蛋白的酶切活性;通过酵母双杂交检测GAF结构域在PprI与RNA聚合酶β亚基互作中的作用,发现截去GAF结构域影响PpIT176A与RNA聚合酶的互作能力,说明GAF结构域可能在RNA聚合酶β亚基的招募中发挥作用;比对 Deinococcus radiodurans 和 Deinnococcus deserti的 GAF 结构域,发现两者的GAF结构域都形成了一个类似空腔的结构,推测其可能会用于结合小分子信号物质,从而行使接受信号的功能;采用等温滴定量热法测定小分子cGMP、cAMP与GAF结构域的结合能力,结果表明,GAF结构域可以结合cGMP,不能结合cAMP;本研究通过一系列生理生化试验,初步探索了 PprI蛋白的GAF结构域在耐辐射奇球菌中的功能,证实GAF结构域通过影响RNA聚合酶的招募在耐辐射奇球菌紫外以及γ损伤抗性中发挥着重要作用,推测其可能是通过结合信号小分子cGMP来响应上游损伤。通过对该结构域的功能研究,为PprI-DdrO介导的DNA损伤响应途径上游响应机制研究奠定了基础。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 主要缩略词
• 第一章 文献综述
•   1.1 耐辐射奇球菌的基本特征
•     1.1.1 耐辐射奇球菌的形态结构特征
•     1.1.2 耐辐射奇球菌基因组信息
•   1.2 耐辐射奇球菌的辐射损伤抗性
•     1.2.1 耐辐射奇球菌的抗性机制
•     1.2.2 耐辐射奇球菌关键基因PprI的研究进展
•     1.2.3 GAF结构域研究进展
•   1.3 本文的研究依据及研究意义
• 第二章 GAF结构域敲除与表型分析
•   2.1 引言
•   2.2 实验材料
•     2.2.1 菌种和质粒
•     2.2.2 设备与配方
•     2.2.3 试验方法
•   2.3 结果分析
•     2.3.1 GAF结构域的敲除结果分析
•     2.3.2 PprI表型试验结果分析
•   2.4 本章小结
• 第三章 蛋白纯化和结构解析
•   3.1 引言
•   3.2 实验材料与设备
•   3.3 试验方法
•     3.3.1 表达质粒的构建
•     3.3.2 蛋白诱导
•     3.3.3 蛋白纯化
•     3.3.4 结晶条件初筛方案
•     3.3.5 结晶条件复筛
•     3.3.6 分析软件与方法
•   3.4 实验结果分析
•     3.4.1 纯化结果分析
•     3.4.2 蛋白序列比对
•     3.4.3 PprI蛋白结构解析
•     3.4.4 PprI的GAF结构域
•   3.5 本章小结
• 第四章 PprI蛋白GAF结构域活性研究
•   4.1 序言
•   4.2 材料与方法
•     4.2.1 实验材料
•     4.2.2 实验方法
•   4.3 实验结果分析
•     4.3.1 PprI蛋白酶切活性分析
•     4.3.2 酵母双杂交试验结果分析
•     4.3.3 滴定实验结果分析
•   4.4 本章小结
• 第五章 总结与展望
•   5.1 总结
•   5.2 展望
• 参考文献

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 罗宇霞

导师: 华跃进

关键词: 耐辐射奇球菌,结构域,亚基

来源: 浙江大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 浙江大学

分类号: Q933

总页数: 88

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