Nrf2在热带爪蟾早期胚胎发育中的表达模式与功能的初步研究

论文摘要

Nrf2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2）属于CNC（Cap’-N’-Collar）转录因子家族成员蛋白,与特异性顺式作用元件ARE（antioxidant response element）结合,并启动下游基因转录。研究表明,约有600多个基因受Nrf2转录调控,其中包含大量的抗氧化酶,II相解毒酶和热休克蛋白等基因。因此,Nrf2是氧化应激调节因子,在氧化应激,细胞保护和抗衰老中发挥着重要作用。然而,最近的研究却发现,过度活化Nrf2会造成小鼠出生后致死,干细胞过度分化而衰竭,肾脏发育不良等负面影响。提示Nrf2不仅参与调控细胞保护基因维持机体内稳态,还参与细胞命运决定,影响生长与发育。但是,到目前为止关于Nrf2在早期胚胎发育中的角色及其作用机制还十分的不清晰。我们以热带爪蟾为模式生物,首先利用qPCR和整体胚胎原位杂交技术（WISH）揭示Nrf2在热带爪蟾胚胎发育过程中的时空表达模式;再通过显微注射Nrf2 mRNA,观察过表达Nrf2对细胞行为,器官原基决定和整体胚胎发育的影响;最后借助RNA-Seq和生物信息学分析,从转录组水平探讨Nrf2调控胚胎发育的分子网络关系。结果显示,Nrf2表达贯穿于热带爪蟾早期胚胎整个发育史:在卵裂期、桑葚期以及囊胚期主要表达于动物极,原肠胚期微弱地表达于胚孔周围;神经胚期表达于脊索部位;在尾牙后期则大量表达于头部、脊柱等重要中枢神经系统区域。有趣是,Nrf2在原肠胚期的表达却骤然降到最低。随后,我们对早期胚胎抗氧化指标进行测定,发现在原肠期时处于最敏感状态。那么,Nrf2究竟在此时期扮演什么角色?通过显微注射过量表达Nrf2,结果发现,胚胎发育异常并出现特异表型。主要表现为:原肠期胚孔闭合异常、神经期胚神经管无法闭合、尾牙期的脊柱弯曲、蝌蚪期出现小眼、晶状体浑浊以及泄殖腔变宽等。随后,对原肠胚和神经胚的转录组研究发现:过表达Nrf2后,原肠胚期参与胚层分化、体轴建立和官原基形成的相关基因显著下调;而神经胚期,过表达Nrf2则显著抑制了神经管、神经脊发育的相关基因并纤毛和细胞运动等相关基因。进一步的KEGG信号通路分析,Nrf2影响了许多信号通路的改变:主要包含细胞粘附、氧化磷酸化,Ca2+、Wnt以及Hedgehog等信号通路。因此,胚胎过表达Nrf2后,造成的发育异常可能是由于下调了这些发育相关的信号通路所导致的结果。综上所述,本研究发现Nrf2是一个母源基因,表达贯穿于整个胚胎发育史,参与神经系统发育。其在胚胎早期胚层分化和细胞命运决定过程中发挥关键作用。本研究通过对Nrf2在胚胎发育中表达模式与功能的初步探讨,我们的研究结果为更好的理解氧化还原信号在胚胎发育过程中的作用机制提供新的视角。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 绪论
•   1.1 Nrf2/ARE氧化信号通路
•     1.1.1 Nrf2基因的结构与功能
•     1.1.2 氧化应激与Nrf2/ARE信号通路
•     1.1.3 氧化应激与胚胎发育
•   1.2 Nrf2异位表达与生物功能
•     1.2.1 Nrf2 GOF（gain of function）
•     1.2.2 Nrf2 LOF（loss of function）
•     1.2.3 Nrf2的分子网络关系
•       1.2.3.1 Nrf2与Notch信号通路
•       1.2.3.2 Nrf2与Wnt信号通路
•       1.2.3.3 Nrf2与PPARγ信号通路
•       1.2.3.4 Nrf2与NF-κB信号通路
•   1.3 热带爪蟾胚胎发育
•     1.3.1 热带爪蟾作为模式生物的特殊性与代表性
•     1.3.2 原肠运动的作用机制
•     1.3.3 Nrf2在胚胎发育过程中的作用机制
•   1.4 本研究的目的、内容和意义
•     1.4.1 实验目的
•     1.4.2 研究内容
•     1.4.3 研究意义
• 第二部分 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 实验动物
•     2.1.2 实验试剂
•     2.1.3 实验仪器
•     2.1.4 溶液的配制
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 热带爪蟾胚胎的获取
•     2.2.2 胚胎总RNA的提取
•     2.2.3 cDNA的合成
•     2.2.4 引物设计
•     2.2.5 定量PCR
•     2.2.6 PCR反应体系
•     2.2.7 PCR产物纯化
•     2.2.8 双酶切反应
•     2.2.9 载体连接反应
•     2.2.10 转化感受态细胞
•     2.2.11 质粒抽提
•     2.2.12 酶切鉴定及纯化
•     2.2.13 Nrf2的地高辛标记探针的制备
•       2.2.13.1 模板的制备
•       2.2.13.2 Nrf2反义探针的合成
•     2.2.14 整体原位杂交
•       2.2.14.1 原位杂交第一天
•       2.2.14.2 原位杂交第二天
•       2.2.14.3 原位杂交第三天
•       2.2.14.4 原位杂交第四天
•     2.2.15 胚胎氧化指标测定
•     2.2.16 Nrf2 mRNA的合成
•       2.2.16.1 模板的制备
•       2.2.16.2 mRNA的合成
•       2.2.16.3 Nrf2 mRNA纯化
•     2.2.17 显微注射
•     2.2.18 RNA seq结果验证
• 第三部分 实验结果与分析
•   3.1 Nrf2基因CDS的克隆
•   3.2 Nrf2基因在热带爪蟾胚胎中的时空表达模式
•     3.2.1 时间表达模式
•     3.2.2 空间表达模式
•       3.2.2.1 Nrf2反义RNA探针的合成
•       3.2.2.2 Nrf2基因的整体原位杂交
•   3.3 Nrf2对早期胚胎发育中抗氧化能力的潜在角色
•   3.4 Nrf2对早期胚胎发育形态影响
•   3.5 Nrf2对早期胚胎发育中基因表达图谱的影响
•     3.5.1 差异基因
•     3.5.2 差异基因的GO分析
•     3.5.3 差异基因的KEGG的pathway分析
•   3.6 胚胎过表达Nrf2后转录组测序数据结果验证
• 第四部分 讨论
•   4.1 Nrf2在早期胚胎发育过程中的角色
•   4.2 Nrf2在细胞命运决定中的作用机制
•   4.3 Nrf2在细胞运动中的潜在功能与机制
•   4.4 氧化应激与critical window的关系
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表学术论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘阿梅

导师: 陈培超

关键词: 胚胎发育,细胞命运决定,原肠运动,氧化应激

来源: 温州大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 温州大学

分类号: Q344

总页数: 66

文件大小: 5013K

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