基于DNAzyme信号放大的比色、荧光方法用于多种miRNA的检测研究

论文摘要

miRNA是一类短的非编码内源性RNA分子,是基因表达和逆转录的关键性调节因子,可以作为细胞分化、增殖或凋亡等生理过程的指标。它与肿瘤生长和抑制过程有密不可分的作用,因此,miRNA的检测对于疾病预防、临床诊断和癌症治疗有重要的价值。由于其具有尺寸小,家族成员之间序列同源性高和丰度低等特征,发展合适的检测miRNA方法具有高挑战性。传统的miRNA检测方法包括Northern印迹,逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）和微阵列等,这些方法虽然可部分满足检测的需求,但具有灵敏度低,设备昂贵,耗时久和操作复杂等缺点,限制了它们在生物医学中的广泛应用。DNAzyme是一类可以催化许多化学反应的单链核酸,具有高稳定性、低非特异性吸附、催化活性好和制备方便等独特的性质,其作为无酶催化反应的信号放大器已被广泛用于DNA、蛋白质和金属离子的高灵敏检测。本论文基于DNAzyme的催化放大特性,发展了两种荧光/比色传感方法,用于多种miRNA目标链的同时分析检测研究:1、基于DNAzyme信号放大的比色传感方法用于多种miRNA的检测研究本章构建了一种双DNAzyme催化放大的比色传感策略:利用8-17 DNAzyme和G-四聚体DNAzyme结合形成底物链,两条裂开的酶链末端与底物链部分互补配对,此时由于构象的错配无法进行切割反应,当靶标链miR-122存在时,DNAzyme的构象重新排列,引发自催化底物链的切割,同时活化的DNAzyme将自动移动至邻近的底物链进一步切割,从而实现第一步的循环放大过程;释放的G-四聚体与Hemin形成G-四聚体/Hemin复合物,有效地催化H2O2使ABTS2-氧化成肉眼可识别的有色产物ABTS·-,从而实现第二步的信号放大过程及目标miRNA的比色检测。此外,通过改变两条酶链末端的碱基可以实现多种miRNA的检测。这种比色方法具有高特异性、操作简单、低成本等优点,具有良好的实用性。2、基于DNAzyme信号放大的悬浮微球阵列用于多种miRNA的检测研究本章首先将标记有荧光基团FAM和猝灭基团Dabcyl的8-17 DNAzyme的底物链分别固定于四种不同尺寸的聚苯乙烯（PS）微球,然后将带有不同miRNA识别片段的裂开型DNAzyme序列与相应的PS球孵育,构建一种基于DNAzyme催化切割放大的悬浮微球阵列。选择miR-21、miR-122、miR-335和miR-155四种miRNA链作为检测对象。在相应靶标miRNA存在下,可以激活DNAzyme导致相应PS球上底物链的切割,导致猝灭基团远离荧光团,PS球的荧光恢复。同时释放的miRNA可以进一步激活DNAzyme实现底物链的自动连续的切割,实现酶促荧光信号的放大。利用流式细胞仪记录不同尺寸的PS微球的荧光信号,从而实现对多种miRNA的同时识别与检测。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
•   1.1 miRNA基本介绍
•   1.2 miRNA的生物学调控功能
•     1.2.1 miRNA在细胞发育中的调控功能
•     1.2.2 miRNA在细胞分化中的调控功能
•     1.2.3 miRNA在免疫系统中的调控功能
•     1.2.4 miRNA在癌症中的异常表达
•     1.2.5 miRNA在其它过程中的调控功能
•   1.3 传统的miRNA检测方法
•     1.3.1 Northern印迹杂交
•     1.3.2 RT-qPCR
•     1.3.3 微阵列法
•     1.3.4 高通量测序技术
•   1.4 新型的miRNA检测方法
•     1.4.1 核酸扩增信号放大法用于miRNA的检测
•     1.4.2 复合纳米探针用于miRNA的检测
•     1.4.3 多重miRNA的检测方法
•   1.5 DNAzyme在 miRNA检测中的应用
•     1.5.1 DNAzyme概述
•     1.5.2 基于DNAzyme的 miRNA检测方法
•   1.6 本论文的选题背景及研究内容
• 第2章 基于DNAzyme信号放大的比色传感方法用于多种miRNA的检测研究
•   2.1 前言
•   2.2 实验部分
•     2.2.1 试剂和仪器
•     2.2.2 溶液的配制
•     2.2.3 细胞培养与总RNA的提取
•     2.2.4 G17S1 探针的制备及可行性考察
•     2.2.5 凝胶电泳实验
•     2.2.6 反应条件的优化
•     2.2.7 G17S1 探针对miRNA的检测
•     2.2.8 G17S1 探针的选择性考察
•     2.2.9 细胞提取物中目标miRNA的分析
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 G17S1 探针对miR-122 的识别原理
•     2.3.2 G17S1 探针构建的可行性研究
• 2+作用的考察研究'>    2.3.3 Pb²⁺作用的考察研究
•     2.3.4 发夹底物链的优化研究
•     2.3.5 Hemin浓度的优化研究
•     2.3.6 pH值的优化研究
•     2.3.7 G17S与 G-A、G-B最佳比例的优化研究
•     2.3.8 G17S1 探针对不同浓度miR-122 的响应研究
•     2.3.9 G17S1 探针对miR-122 的选择性研究
•     2.3.10 四种传感体系的构建及用于目标miRNA的识别检测研究
•     2.3.11 细胞提取物中目标miRNA的检测研究
•   2.4 小结
• 第3章 基于DNAzyme信号放大的悬浮微球阵列用于多种miRNA的检测研究
•   3.1 前言
•   3.2 实验部分
•     3.2.1 试剂和仪器
•     3.2.2 溶液的配制
•     3.2.3 不同探针PS-17S-21/122/335/155 的构建
•     3.2.4 PS-17S-21 探针的可行性考察
•     3.2.5 实验条件的优化
•     3.2.6 流式细胞仪检测不同浓度的miRNA
•     3.2.7 选择性的考察
•     3.2.8 缓冲溶液中四种探针的分型检测
•     3.2.9 血清中四种探针的分型检测
•   3.3 结果与讨论
•     3.3.1 PS-17S-21 传感平台对miR-21 的识别原理
•     3.3.2 PS-17S-21 探针构建的可行性研究
• 2+浓度的优化研究'>    3.3.3 Mg²⁺浓度的优化研究
•     3.3.4 反应温度的优化研究
•     3.3.5 反应时间的优化研究
•     3.3.6 PS-17S-21 探针对不同浓度miR-21 的检测研究
•     3.3.7 PS-17S-21 探针对miR-21 的选择性研究
•     3.3.8 悬浮微球阵列用于缓冲溶液中多种miRNA的同时识别检测研究
•     3.3.9 悬浮微球阵列用于血清中多种miRNA的同时识别检测研究
•   3.4 小结
• 结论与展望
• 参考文献
• 附录 攻读硕士期间所发表的学术论文
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 宋丽冉

导师: 李继山

关键词: 比色检测,悬浮微球阵列,信号放大

来源: 湖南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,化学

单位: 湖南大学

分类号: O657.3;Q503

DOI: 10.27135/d.cnki.ghudu.2019.000179

总页数: 70

文件大小: 2485K

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