通过调控H3K9甲基化及DNA羟甲基化促进绵羊克隆胚胎发育的研究

论文摘要

近二十余年来,尽管体细胞克隆技术在多种动物上取得了成功,但其效率低下一直阻碍着该技术的生产化应用。研究者们为提高克隆效率做出了很多努力,但效果并不理想。因此,提高体细胞克隆效率仍需进一步研究和探索。体细胞克隆效率低的一个主要原因是克隆胚胎的表观遗传重编程不彻底,其中涉及DNA甲基化,组蛋白乙酰化以及组蛋白甲基化等。最近的研究发现,组蛋白H3第9位赖氨酸三甲基化（H3K9me3）是小鼠克隆胚胎有效重编程的关键障碍。本论文对绵羊早期体外受精胚胎和克隆胚胎中H3K9me3和H3K9二甲基化（H3K9me2）的水平进行了比较,发现在绵羊克隆胚胎的原核期、2-细胞期和囊胚期,H3K9me3/2的水平显著高于同时期的体外受精胚胎。为调控克隆胚胎的H3K9me3/2水平,本论文分别使用组蛋白甲基转移酶SUV39的抑制剂毛壳素和组蛋白赖氨酸去甲基化酶KDM4D处理供体细胞或克隆胚胎。结果显示10 nM毛壳素能够有效降低供体细胞中H3K9me3/2的水平,并且这一作用能持续到克隆胚胎的2-细胞阶段,但克隆胚胎的囊胚率没有显著变化。使用10nM毛壳素直接处理克隆胚胎24 h也能显著降低H3K9me3/2的水平,但毛壳素处理后会抑制胚胎的发育。使用原核表达纯化的人源重组KDM4D蛋白处理供体细胞,能显著降低细胞中H3K9me3/2的水平,处理的供体细胞核移植后克隆胚胎囊胚率显著升高,囊胚细胞数显著增多,且囊胚中的多能性基因SOX2、CDX2和NANOG的表达水平显著升高。克隆胚胎中DNA甲基化的异常也是影响其发育的一个重要因素。克隆胚胎早期发育过程中存在高水平的5-甲基胞嘧啶（5mC）。5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）是5mC发生去甲基化第一步的氧化产物,提高5hmC的水平是否能促进克隆胚胎的发育还不得而知。维生素C作为Fe2+和α-酮戊二酸（20G）依赖的双加氧酶的辅因子能通过促进10-11易位甲基胞嘧啶双加氧酶（Ten-eleven translocation,TET）的活性使5hmC水平升高。本论文研究了维生素C在小鼠和绵羊胚胎早期发育中的作用以及对胚胎表观修饰的影响。研究发现,使用维生素C处理绵羊胎儿成纤维细胞,能使细胞中的5hmC水平升高,而5mC水平不变,处理后的细胞用于核移植对克隆胚胎的体外发育没有显著影响。维生素C处理血清饥饿的绵羊胎儿成纤维细胞,能使细胞中的5hmC水平升高,并且5mC水平降低,处理后的细胞进行核移植尽管囊胚率没有显著升高,但克隆囊胚中的多能性基因KLF4和SOX2的表达水平升高了。在小鼠的卵子体外成熟或受精卵的体外培养过程中添加200 μM维生素C,都能有效促进小鼠胚胎的体外发育。在绵羊胚胎体外培养液中添加相对较低浓度的维生素C也能有效促进绵羊体外受精胚胎（10μM、50μM）和克隆胚胎（10 μM）的体外发育,并且维生素C处理组的囊胚中5hmC水平升高了。综上,绵羊克隆胚胎在1-细胞、2-细胞和囊胚阶段都表现为高水平的H3K9me3/2;毛壳素和人源重组KDM4D蛋白都能使供体细胞中H3K9me3/2水平降低,其中人源重组KDM4D蛋白能促进克隆胚胎的发育;维生素C处理血清饥饿的供体细胞能使细胞中5hmC水平升高、5mC水平降低,并在一定程度上提高了克隆囊胚的质量;维生素C直接处理克隆胚胎或体外受精胚胎均能促进胚胎的体外发育。本论文研究结果对改进哺乳动物体细胞克隆技术程序,提高技术效率有参考价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 绪论
•   1.1 体细胞核移植（SCNT）概述
•   1.2 SCNT胚胎中的异常表观修饰
•   1.3 SCNT胚胎中表观修饰异常的修复
•   1.4 本研究的目的和意义
• 第二章 实验材料与方法
•   2.1 实验材料
•   2.2 实验仪器及耗材
•   2.3 常用液体配方
•   2.4 实验方法与步骤
•   2.5 数据处理与分析
• 第三章 实验结果与分析
•   3.1 绵羊植入前体外受精胚胎和克隆胚胎H3K9甲基化水平的比较
•   3.2 毛壳素对克隆胚胎体外发育的影响
•   3.3 KDM4D蛋白对克隆胚胎体外发育的影响
•   3.4 维生素C处理供体细胞对克隆胚胎发育的影响
•   3.5 维生素C处理胚胎对胚胎体外发育的影响
• 第四章 讨论
•   4.1 毛壳素在绵羊克隆胚胎体外发育中的影响
•   4.2 重组KDM4D蛋白处理供体细胞对绵羊克隆胚胎体外发育的影响
•   4.3 维生素C对胚胎发育的影响
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介

文章来源

类型: 博士论文

作者: 张玉梅

导师: 侯健,安晓荣

关键词: 体细胞核移植,毛壳素,组蛋白去甲基化酶,甲基化,维生素

来源: 中国农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 中国农业大学

分类号: Q813

总页数: 149

文件大小: 12307K

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