NS1与NOLC1相互作用对流感病毒（H1N1）复制的影响

论文摘要

A型流感病毒是引发大规模流感疫情爆发的主要原因,其中NS1蛋白是A型流感病毒编码的一个重要的病毒因子,在被感染的细胞中发挥着重要的作用。人核仁磷酸化蛋白1（NOLC1）是一个高度磷酸化的哺乳动物蛋白。本实验室在前期,已经通过多种试验证明,H5N1亚型NS1蛋白与宿主细胞NOLC1蛋白存在相互作用,但NS1与NOLC1蛋白相互作用对流感病毒复制的影响还尚不清楚。本论文首先通过免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）技术对H1N1亚型流感病毒NS1蛋白与宿主细胞NOLC1蛋白相互作用进行验证,并深入研究了NS1与NOLC1相互作用对流感病毒H1N1（PR8）复制的影响,结果如下:1.构建并筛选出NOLC1蛋白敲降稳转株（pLKO.1-TRC-NOLC1）和过表达稳转株（pBABE-puro-NOLC1）;确定鸡胚扩增出的流感病毒H1N1（PR8）的病毒滴度为1.0×108,胰酶浓度为2μg.mL-1、MOI=1.0,为流感病毒H1N1（PR8）在宿主细胞中增殖的最适条件。2.用流感病毒H1N1（PR8）分别感染pBABE-puro-NOLC1、pLKO.1-TRC-NOLC1和A549三种细胞系,不同感染时间收集样品,一方面通过TCID50技术检测病毒滴度;另一方面采用Real-time PCR技术检测病毒NP基因的三种RNA表达水平。结果表明,3株细胞系中流感病毒H1N1（PR8）的病毒滴度均在24h时达到最高,随后出现下降趋势;相比较正常细胞,NOLC1过表达稳转株中病毒的滴度增加,病毒NP RNA水平升高,而NOLC1敲降稳转株中病毒的滴度降低,病毒NP RNA水平降低。从上述试验结果中得出病毒的复制水平与宿主内NOLC1的表达量存在正相关关系。3.为了探索NS1与NOLC1相互作用对流感病毒H1N1（PR8）复制的影响,对宿主感染H1N1（PR8）后不同时间内NOLC1mRNA表达水平进行检测,发现病毒感染宿主细胞后的48h内,NOLC1mRNA的表达量整体呈现下降的趋势,结合上述实验结果我们可以得知,在病毒感染过程中,宿主通过NOLC1蛋白与流感病毒的NS1蛋白相互作用,降低了病毒的复制水平,进而影响流感病毒的感染进程。综上,本研究揭示了NOLC1与NS1相互作用对流感病毒感染过程的影响,为开发治疗IAV引起的疾病药物的设计提供新思路。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 引言
•   0.1 A型流感病毒
•     0.1.1 背景
•     0.1.2 A型流感病毒的基因组结构
•     0.1.3 NS1 蛋白简介
•     0.1.4 病毒在宿主细胞中的复制
•   0.2 NOLC1 蛋白
•   0.3 基因治疗
•     0.3.1 背景
•     0.3.2 慢病毒载体简介
•     0.3.3 RNA干扰技术
•   0.4 研究目的及意义
• 第1章 NS1 蛋白与宿主NOLC1 蛋白相互作用验证
•   1.1 前言
•   1.2 材料与试剂
•     1.2.1 细胞株、病毒毒株、载体
•     1.2.2 主要试剂
•     1.2.3 溶液配置
•     1.2.4 仪器及耗材
•   1.3 实验方法
•     1.3.1 PCAGGS-FLAG-NOLC1 真核表达载体的构建及鉴定
•     1.3.2 PCAGGS-HA-NS1、 （120D/195R）、（120D）、（195R）（H1N1）真核表达载体的构建及鉴定
•     1.3.3 NS1（H1N1）蛋白与宿主NOLC1 蛋白相互作用以及关键作用位点协同验证
•   1.4 实验结果
•     1.4.1 PCAGGS-FLAG-NOLC1 真核表达载体的构建及鉴定
•     1.4.2 PCAGGS-HA-NS1、（120D/195R）、（120D）、（1955R）（H1N1）真核表达载体的构建及鉴定
•     1.4.3 NS1（H1N1）蛋白与宿主NOLC1 蛋白相互作用以及关键位点协同作用验证..
•   1.5 结果讨论
• 第2章 NOLC1基因慢病毒过表达和敲降表达稳转株的构建以及筛选
•   2.1 前言
•   2.2 材料与试剂
•     2.2.1 细胞株、病毒毒株、载体
•     2.2.2 主要试剂
•     2.2.3 溶液配置
•     2.2.4 仪器及耗材
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 慢病毒重组p BABE-puro-FLAG-NOLC1 真核表达载体的构建及鉴定
•     2.3.2 慢病毒干扰载体pLKO.1-TRC..NOLC1 的构建及鉴定
•     2.3.3 嘌呤霉素工作浓度的确定
•     2.3.4 慢病毒包装以及稳转株筛选
•     2.3.5 Western Blot技术检测过表达和敲降表达稳转株中NOLC1 蛋白含量
•   2.4 实验结果
•     2.4.1 慢病毒重组p BABE-puro-FLAG-NOLC1 真核表达载体、慢病毒干扰载体pLKO.1-TRC-NOLC1 的构建以及鉴定
•     2.4.2 嘌呤霉素工作浓度的确定
•     2.4.3 Western Blot技术检测过表达和敲降表达稳转株中NOLC1 蛋白含量
•   2.5 结果讨论
• 第3章 流感病毒H1N1（PR8）在宿主细胞中培养条件的优化
•   3.1 前言
•   3.2 材料与试剂
•     3.2.1 细胞株、病毒毒株、载体
•     3.2.2 主要试剂
•     3.2.3 溶液配置
•     3.2.4 仪器及耗材
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 A型流感病毒H1N1（PR8）的扩增及效价检测
•     3.3.2 胰酶浓度对流感病毒增殖的影响
•     3.3.3 病毒滴度的确定以及感染复数对流感病毒增殖的影响
•   3.4 实验结果
•     3.4.1 A型流感病毒H1N1（PR8）扩增及效价测定
•     3.4.2 胰酶浓度对流感病毒增殖的影响
•     3.4.3 病毒滴度的确定以及感染复数对流感病毒增殖的影响
•   3.5 结果与讨论
• 第4章 NS1与NOLC1 相互作用对流感病毒H1N1（PR8）复制的影响
•   4.1 前言
•   4.2 材料与试剂
•     4.2.1 细胞株、病毒毒株、载体
•     4.2.2 主要试剂
•     4.2.3 溶液配置
•     4.2.4 仪器及耗材
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 NOLC1 蛋白对病毒增殖的影响
•     4.3.2 NOLC1 蛋白对病毒复制的影响
•     4.3.3 H1N1（PR8）对NOLC1mRNA表达水平的影响
•   4.4 实验结果
•     4.4.1 NOLC1 蛋白对病毒增殖情况的影响
•     4.4.2 NOLC1 蛋白对病毒复制水平的影响
•     4.4.3 H1N1（PR8）对宿主细胞NOLC1 mRNA表达水平的影响
•   4.5 结果讨论
• 第5章 结论与展望
•   5.1 结论
•   5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文及参加科研情况
• 附录一 试剂及其配制一览表
• 附录二 主要仪器与耗材一览表

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘美辰

导师: 朱春玉

关键词: 蛋白,稳转株,流感病毒复制

来源: 辽宁大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 辽宁大学

分类号: Q939.4

总页数: 66

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