赤杆菌来源HSL家族酯酶的酶学表征与晶体结构研究

论文摘要

酯酶可催化酯类的水解、合成和酯交换,在真核生物和原核生物中广泛存在。食品、化妆品和医药等工业用酯酶大多为细菌来源,其中细菌HSL家族酯酶因底物谱较广且具有严苛条件的适应性等特点,已被应用于食品香料制备和食品安全检测。不同细菌来源HSL家族酯酶的催化特性差异较大,开展蛋白结构研究对解释其结构与催化特性之间的关系和指导酶工程改造至关重要。本研究从具有烷烃降解能力的赤杆菌基因组中筛选新型HSL家族酯酶,通过酶学表征和晶体结构研究,为细菌HSL家族酯酶的催化机制和功能研究提供数据支持。从13株赤杆菌科细菌基因组中利用序列比对筛选出12个HSL家族酯酶。经氨基酸序列分析以及通过基因克隆、异源表达和纯化,确定了两个可溶性表达量大、性质稳定酯酶Poc14和Pot7作为研究对象。其中,酯酶Poc14的分子量为35.7 kDa,酯酶Pot7的分子量大小为33.7 kDa。酶学性质表征结果显示酯酶Poc14和Pot7的最适底物都为对硝基苯酚己酸酯,最适反应条件:温度为55?C,pH为6.0–9.0。酯酶Poc14和Pot7具有较强的热稳定性,对NaCl、多种金属离子和有机溶剂具有很强的耐受性,并且相比Pot7,Poc14的耐受能力更强。此外,Poc14和Pot7都能降解邻苯二甲酸酯,表明酯酶Poc14和Pot7可用于邻苯二甲酸酯类物质的检测。对酯酶Poc14和Pot7开展蛋白结构研究,通过蛋白结晶,晶体X射线衍射数据的收集以及利用分子置换法进行晶体结构的解析,获得了分辨率为1.8?的酯酶Poc14的晶体结构和分辨率为2.1?的酯酶Pot7的晶体结构。酯酶Poc14和Pot7晶体结构的成功解析为研究HSL家族酯酶的结构、功能和催化机制提供了数据支持。综上所述,本研究通过生物信息学分析筛选得到了具有优良的酶学性质的HSL家族酯酶Poc14和Pot7,并成功解析了两个酯酶蛋白的晶体结构,为研究细菌HSL家族酯酶催化机制和功能奠定了基础,为食品工业提供了潜在的酶制剂。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 酯酶概述
•     1.1.1 酯酶定义及特点
•     1.1.2 酯酶的来源
•     1.1.3 酯酶的结构特征及催化机制
•   1.2 细菌来源酯酶的分类与筛选
•     1.2.1 细菌酯酶家族特征
•     1.2.2 细菌酯酶的筛选方法
•   1.3 细菌HSL家族酯酶的研究现状
•     1.3.1 细菌HSL家族水解酶的在食品中的应用
•     1.3.2 细菌HSL家族酯酶结构特征与催化机制
•   1.4 立题依据与研究意义
•   1.5 主要研究内容
• 第二章 赤杆菌HSL家族酯酶基因筛选与分析
•   2.1 试验方法
•     2.1.1 酯酶基因的筛选
•     2.1.2 HSL家族酯酶的系统发育分析
•     2.1.3 HSL家族酯酶氨基酸序列的多重序列比对分析
•   2.2 结果分析
•     2.2.1 HSL家族酯酶基因筛选
•     2.2.2 HSL家族酯酶基因的系统发育分析
•     2.2.3 HSL家族酯酶多序列比对分析
•   2.3 小结与讨论
• 第三章 HSL家族酯酶的异源表达与纯化
•   3.1 材料和方法
•     3.1.1 菌株与质粒载体
•     3.1.2 工具酶与试剂盒
•     3.1.3 培养基与培养条件
•     3.1.4 仪器与设备
•     3.1.5 试剂及溶液配制
•     3.1.6 酯酶基因克隆
•     3.1.7 重组表达载体的构建
•     3.1.8 酯酶的异源表达
•     3.1.9 酯酶蛋白纯化
•   3.2 结果分析
•     3.2.1 HSL家族酯酶基因克隆
•     3.2.2 HSL家族酯酶的表达纯化
•   3.3 小结与讨论
• 第四章 HSL家族酯酶的酶学性质研究
•   4.1 材料和方法
•     4.1.1 药品与试剂
•     4.1.2 仪器与设备
•     4.1.3 试剂与溶液配制
•     4.1.4 酶学性质测定
•     4.1.5 酯酶Poc14和Pot7 水解邻苯二甲酸酯的样品制备
•     4.1.6 酯酶Poc14和Pot7 水解邻苯二甲酸酯产物的检测
•   4.2 结果分析
•     4.2.1 酯酶Poc14和Pot7 的蛋白浓度测定
•     4.2.2 酯酶Poc14 酶学性质表征
•     4.2.3 酯酶Pot7 酶学性质表征
•     4.2.4 酯酶Poc14和Pot7 的酶学性质比较
•     4.2.5 酯酶Poc14 N端截短体的底物特异性和动力学参数测定
•     4.2.6 酯酶Poc14 水解DEP和 DEHP的 LC/MS检测结果初步分析
•     4.2.7 酯酶Pot7 水解DEP和 DEHP的 LC/MS检测结果初步分析
•   4.3 小结与讨论
• 第五章 HSL家族酯酶的晶体结构研究
•   5.1 材料和方法
•     5.1.1 晶体筛选试剂
•     5.1.2 仪器与设备
•     5.1.3 蛋白晶体培养及初筛
•     5.1.4 蛋白晶体优化
•     5.1.5 晶体衍射数据收集和初步处理
•     5.1.6 晶体结构解析
•   5.2 结果分析
•     5.2.1 酯酶Poc14和Pot7 的晶体筛选及优化结果
•     5.2.2 酯酶Poc14 晶体衍射数据收集与解析
•     5.2.3 酯酶Poc14 晶体结构质量评估
•     5.2.4 酯酶Pot7 晶体衍射数据收集与解析
•     5.2.5 酯酶Pot7 晶体结构质量评估
•     5.2.6 酯酶Poc14和Pot7 的结构比较
•   5.3 小结与讨论
• 第六章 主要结论和展望
•   6.1 结论
•   6.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 在读学位期间发表论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 洪利国

导师: 崔恒林,许学伟

关键词: 赤杆菌,酯酶,异源表达,酶学表征,晶体结构

来源: 江苏大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 江苏大学

分类号: Q936

总页数: 95

文件大小: 7344K

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