miR-52通过抑制非经典Wnt信号通路VANG-1/Van Gogh延长秀丽隐杆线虫寿命的研究

论文摘要

Wnt信号通路,包括经典和非经典途径,在进化过程中高度保守。该信号通路主要调控胚胎发育过程的多种生物学事件,包括细胞凋亡、细胞不对称分裂、细胞迁移和突触形成等。近年来有研究发现,Wnt信号通路不仅调控胚胎发育,同时也调控发育后的生物体衰老进程,其中包括参与糖尿病、癌症等衰老相关疾病的调控。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans,C.elegans）,由于其生命周期短,调控衰老的通路与哺乳动物高度保守等优点,是研究衰老的经典模式生物之一。已有研究表明,Wnt信号通路相关基因缺失会导致线虫寿命的延长或缩短,这说明Wnt信号通路基因参与线虫衰老进程的调控。在本研究中我们发现,部分Wnt通路基因的表达水平,随着线虫的衰老进程明显下降。但是,抑制Wnt通路基因表达并影响生物体衰老进程的分子机制尚不清晰。真核基因表达的调控途径主要包括基因水平、转录水平、转录后水平、翻译水平和翻译后水平的调控。其中,microRNA（miRNA）是通过与靶基因的3’UTR区的结合位点互补配对,在转录后水平抑制基因表达的一类短链非编码RNA。大量文献报道,miRNA对哺乳动物和线虫的寿命以及人类衰老相关疾病都具有调控作用。因此,我们推测miRNA可能抑制Wnt通路基因在生物体衰老过程中的表达水平,从而改变线虫寿命。为了筛选抑制Wnt通路基因表达并调控衰老过程的miRNA,我们首先利用Targetscan软件以目前已报道的调控线虫寿命的六个Wnt通路成员（egl-20、cwn-2、lin-44、mom-2、vang-1和bar-1）为靶基因,预测到了可能抑制以上基因在衰老过程中表达的高度保守miRNA家族,miR-51家族。miR-51家族隶属于古老的miR-100家族,其在线虫中有六个成员,分别为miR-51、miR-52、miR-53、miR-54、miR-55和miR-56。随后,通过对miR-51家族成员的突变体线虫进行寿命检测和基因回复实验,我们发现该家族中只有miR-52显著延长线虫寿命,并且其表达水平随着衰老进程逐渐上调。接下来,我们利用荧光素酶双报告实验,筛选出非经典Wnt信号通路的成员VANG-1/Van Gogh是miR-52的靶基因。利用CRISPR-Cas9技术,我们构建了稳定表达Pvang-1::gfp::vang-1 3’UTR的线虫品系。通过比较处于L4、Young Adult、Day 1、Day 3、Day 7和DAY 11各阶段线虫的荧光强度,我们发现进入成虫期后,VANG-1/Van Gogh的表达水平随着衰老进程持续下调。利用突变体和RNAi进行寿命检测实验,我们发现miR-52通过抑制VANG-1表达延长线虫寿命,而且该过程依赖于线虫生殖腺的存在。DAF-16/FOXO是生殖腺信号下游的重要转录因子。通过检测DAF-16在肠道细胞核的定位以及其靶基因的表达水平,我们发现,DAF-16/FOXO的活性在miR-52通过VANG-1延长线虫寿命的过程中是必需的。以上结果表明,miR-52促进线虫寿命的延长依赖于非经典Wnt通路成员VANG-1/Van Gogh,并且该调控过程依赖生殖腺的存在和转录因子DAF-16/FOXO的激活。本研究结果对于进一步发现miRNA通过调控Wnt信号通路参与人类衰老相关疾病发生发展进程的机制提供了新的线索。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 研究背景
•   一、生物体的衰老
•     （一）衰老与疾病的关系
•     （二）衰老与氧化应激的关系
•     （三）寿命是衰老的重要指标之一
•     （四）秀丽线虫是适于研究衰老的模式生物之一
•   二、调控生物体衰老的通路
•     （一）胰岛素（Insulin/IGF-1）信号通路
•     （二）生殖腺信号通路
•     （三）饮食限制信号通路
•     （四）线粒体呼吸链／ATP合成体系信号通路
•     （五）DAF-16/FOXO
•   三、Wnt信号通路
•     （一）经典和非经典Wnt信号通路
•     （二）Wnt通路对发育过程的调控
•     （三）Wnt通路在发育后的生物学功能
•     （四）非经典Wnt通路成员VANG-1/Van Gogh的研究进展
•   四、miRNAs调控生物体衰老
•     （一）miRNA概述
•     （二）miRNA调控哺乳动物衰老进程
•     （三）miRNA调控秀丽线虫寿命
•   五、秀丽线虫miR-51 家族（miR-51/52/53/54-56）
•     （一）miR-51 家族成员概述
•     （二）miR-51 家族调控秀丽线虫胚胎发育
•   六、本论文的研究内容
•     （一）立题依据
•     （二）本文的研究内容及意义
• 第二部分 实验材料与方法
•   一、实验材料
•     （一）秀丽线虫品系
•     （二）细菌菌株
•     （三）主要试剂
•     （四）主要仪器
•   二、实验方法
•     （一）基本试剂配制
•     （二）秀丽线虫的培养和同期化处理
•     （三）秀丽线虫寿命检测
•     （四）秀丽线虫氧压力条件下存活率检测
•     （五）秀丽线虫RNA提取
•     （六）RT-qPCR
•     （七）荧光素酶双报告分析
•     （八）秀丽线虫杂交实验
•     （九）DAF-16::GFP细胞核定位分析
•     （十）转基因线虫构建
•   三、统计分析
• 第三部分 实验结果与分析
•   一、miR-51 家族是抑制衰老过程中Wnt通路基因表达的候选因子
•     （一）Wnt通路基因在线虫衰老进程中的表达变化
•     （二）miR-51 家族是抑制衰老进程中Wnt通路基因表达的候选miRNA
•   二、miR-52 延长线虫寿命
•     （一）miR-51 家族成员对线虫寿命的调控作用
•     （二）miR-52 促进线虫寿命的延长
•     （三）miR-52 增强线虫对氧化应激的耐受性
•   三、miR-52 的表达随衰老进程逐渐增加
•   四、非经典Wnt通路成员VANG-1/Van Gogh是 miR-52 的靶基因
•     （一）miR-52 抑制非经典Wnt通路成员VANG-1 的表达
•     （二）miR-52 缺失上调VANG-1 的表达水平
•   五、VANG-1/Van Gogh的表达水平随衰老进程表达逐渐下降
•   六、miR-52 通过抑制VANG-1 表达延长线虫寿命
•   七、miR-52 通过VANG-1 延长线虫寿命的过程依赖于生殖腺
•   八、miR-52 通过VANG-1 延长线虫寿命依赖DAF-16/FOXO的激活
• 第四部分 讨论
•   一、miR-51 家族成员的功能具有差异
•   二、miR-51 通过GLO/AP-3 通路调控线虫GABAergic神经元突触功能
•   三、VANG-1 在线虫衰老进程中表达水平的变化
•   四、miR-100 家族在衰老相关疾病中对Wnt通路的调控
• 结论和创新点
•   一、结论
•   二、创新点
• 参考文献
• 附录一
• 附录二
• 附录三
• 附录四
• 附录五
• 附录六
• 附录七
• 附录八
• 致谢
• 在学期间公开发表论文及著作情况

文章来源

类型: 博士论文

作者: 张帅

导师: 黄百渠

关键词: 秀丽隐杆线虫,寿命,通路

来源: 东北师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 东北师范大学

分类号: Q756

总页数: 116

文件大小: 7599K

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