番茄SlOMTs基因序列分析及褪黑素合成相关基因SlCOMT1的克隆及功能鉴定

论文摘要

甲基化是植物体内一种常见的酶促反应,大多数次生代谢物质的甲基化均受氧甲基转移酶（O-methyltransferase,OMT）的催化调控,该酶可催化植物次级代谢物质的甲基化和褪黑素的合成,进而影响植物的生长发育以及植物对生物胁迫和非生物胁迫的抵抗能力。OMT可分为CCoAOMT类型和COMT两种类型,其中属于COMT类型的COMT蛋白在调控褪黑素合成途径中起到关键作用。褪黑素可作为生长调节剂参与调控植物的生长发育,并且可增强植物应对生物胁迫与非生物胁迫的能力。本研究以番茄为试材,对OMT家族的基因序列及蛋白序列进行了生物信息学分析,并克隆了COMT类型的褪黑素合成相关基因SlCOMT1;随后,将该基因转入番茄对其功能进行了初步探讨,为揭示褪黑素调控番茄的生长发育分子机理及创制抗盐性较强的新种质奠定理论基础。主要研究结果如下:1.番茄SlOMT家族基因编码COMT类型和CCoAOMT类型的氧甲基转移酶在番茄基因组中分离得到18个OMT基因,分别命名为SlOMT1-18,这些基因分布在8条染色体上,基因长度在726 bp到1338 bp之间;由这些基因编码的蛋白分为两种类型:SlOMT1-9编码COMT类型的氧甲基转移酶,SlOMT10-18编码CCoAOMT类型的氧甲基转移酶。2.SlOMTs基因表达模式为组成型表达SlOMTs基因在番茄的芽、根、茎、叶、花和果实中均有不同程度的表达。在芽中表达较高的基因分别有SlOMT4,SlOMT2,SlOMT13,SlOMT14和SlOMT15:在花中表达较高的基因分别有SlOMT4,SlOMT9,SlOMT13,SlOMT14和SlOMT15;在根中表达较高的基因分别有SlOMT2,SlOMT10,SlOMT11,SlOMT12,SlOMT13和SlOMT14;果实中表达量较高的是SlOMT6,SlOT11与SlOMT9。3.SlCOMT1基因与拟南芥AtCOMT同源性最高,其编码的蛋白定位在细胞质中通过与拟南芥AtCOMT蛋白进行同源比对,从番茄中分离得到比例最高的SlOMT1基因,与之前的SlOMT2基因一致。SlCOMT1基因全长为1023 bp,编码341 aa,蛋白为37 kD,该基因在根中的表达量最高,其编码的蛋白定位于细胞质中。4.SlCOMT1过量表达转基因番茄抵抗盐胁迫的能力增强,获得抗盐性增强的转基因番茄本研究获得了过量表达SlCOMT1转基因番茄并进行了表型鉴定,与野生型相比,转基因株系中的褪黑素含量增加,在高浓度盐胁迫的处理下,其抗盐能力明显高于野生型。此外,转基因番茄体内的脯氨酸含量明显升高,过氧化氢和超氧阴离子的含量有所下降,说明转基因番茄体内增加的褪黑素可通过提高SOD、POD的活性来增强植株对非生物胁迫的抗性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
•   1.1 植物OMT家族简介
•     1.1.1 植物OMT的分类
•     1.1.2 植物OMT家族的功能
•   1.2 植物褪黑素
•     1.2.1 植物褪黑素的简介
•     1.2.2 植物褪黑素的研究概况
•   1.3 番茄中褪黑素研究现状
•   1.4 本实验研究目的以及意义
• 第二章 材料与方法
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 材料
•       2.1.1.1 植物材料
•       2.1.1.2 菌株
•       2.1.1.3 载体
•       2.1.1.4 药品、酶、抗生素、生化试剂和仪器
•       2.1.1.5 培养基及抗生素
•     2.1.2 实验方法
•       2.1.2.1 番茄中SlOMT家族基因生物信息学分析
•       2.1.2.2 植物基因组DNA提取
•       2.1.2.3 植物总RNA提取
•       2.1.2.4 去除基因组DNA反应
•       2.1.2.5 反转录反应
•       2.1.2.6 实时荧光定量分析（qRT-PCR）
•       2.1.2.7 基因克隆
•       2.1.2.8 胶回收
•       2.1.2.9 连接克隆载体
•       2.1.2.10 转化大肠杆菌
•       2.1.2.11 PCR阳性克隆筛选
•       2.1.2.12 送样测序
•       2.1.2.13 提取质粒DNA
•       2.1.2.14 质粒酶切
•       2.1.2.15 构建植物过量表达载体以及原核表达载体
•       2.1.2.16 农杆菌转化
•       2.1.2.17 侵染番茄叶片
•       2.1.2.18 瞬时转化烟草
•       2.1.2.19 褪黑素含量测定
•       2.1.2.20 脯氨酸含量测定
•       2.1.2.21 过氧化氢含量测定
•       2.1.2.22 超氧阴离子含量测定
• 第三章 结果与分析
•   3.1 番茄基因组编码18个SlOMT基因
•   3.2 番茄SlOMT家族基因的染色体定位分析
•   3.3 番茄OMT家族基因结构以及元件分析
•   3.4 SlOMT家族基因的表达分析
•   3.5 SlCOMT1基因序列克隆以及序列分析
•   3.6 构建SlCOMT1的系统进化树
•   3.7 SlCOMT1定位于细胞质中
•   3.8 过量表达SlCOMT1转基因番茄的验证
•   3.9 过表达SlCOMT1转基因番茄植株褪黑素含量及对盐胁迫的抗性增加
• 第四章 讨论
• 第五章 结论
• 附录1 培养基配方
• 附录2 反应体系
• 附录3 引物设计
• 参考文献
• 缩略词表
• 攻读硕士学位期间完成的科研成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 孙晓帅

导师: 刘丹丹

关键词: 番茄,褪黑素,功能验证

来源: 云南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,园艺

单位: 云南大学

基金: 国家自然科学基金(项目编号:31660566)《苹果砧木平邑甜茶PcG蛋白MhMSI1调控单性生殖的分子机理》

分类号: Q943.2;S641.2

总页数: 64

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