大丽轮枝菌跨膜蛋白VdSho1调控穿透能力及黑色素合成的分子机制研究

论文摘要

大丽轮枝菌是引起黄萎病的重要病原真菌,其寄主范围广泛,可侵染包括棉花、番茄、莴苣等重要的经济作物在内的数百种双子叶植物。Sho1是一个具有四次跨膜结构域的膜感受器蛋白,参与影响真菌多种生物学功能,但在大丽轮枝菌中尚未发现其调控致病机理的报道。现有研究对大丽轮枝菌VdSho1致病性功能进行了鉴定,但其具体的调控机理并不明确。本论文针对VdSho1及下游MAPK信号通路元件在调节大丽轮枝菌穿透纤维素膜及黑色素合成方面的功能进行了分析,得到以下4个主要研究结果:1.基因敲除实验表明VdSho1具有调控大丽轮枝菌纤维素膜穿透能力的功能。转录组测序分析结果表明VdSho1正向调节黑色素合成相关基因表达。同时,黑色素合成抑制剂显著降低野生型菌丝穿透能力,表明黑色素促进大丽轮枝菌菌丝穿透过程。综上所述,VdSho1通过调控黑色素的水平,调节大丽轮枝菌对纤维素膜的穿透能力。2.酵母双杂交实验显示,VdSho1可通过C端胞内区与MAPK信号通路调节蛋白Vst50相互作用。RNA-seq结果显示Vst50与VdSho1调控基因群高度重合。分析Vst50和VdSho1的遗传调控关系,结果表明VdSho1位于Vst50上游,二者共同调节穿透能力及黑色素合成过程。另外,敲除MAPK信号通路元件Vst7、Vst11基因,均显著降低穿透能力及黑色素合成水平。酵母双杂交结果显示,Vst50分别与Vst7、Vst11相互作用,突变Vst50蛋白中与Vst7、Vst11互作的结构域,病原菌穿透能力及黑色素合成水平显著降低,表明Vst50-Vst7-Vst11组成的MAPK级联通路对于大丽轮枝菌侵染纤维素膜具有重要作用。3.纤维素膜穿透实验表明,敲除VdSho1任意跨膜结构域,均严重影响大丽轮枝菌穿透能力及黑色素合成水平,表明跨膜结构域是维持VdSho1功能所必须的。提高孢子悬浮液中甘油含量,大丽轮枝菌穿透纤维素膜能力显著降低,表明大丽轮枝菌穿透过程需要细胞维持一定的膨胀压力。1 M甘油处理,野生型菌株中黑色素合成相关基因表达量略微升高,而ΔSho1突变体中黑色素合成基因水平显著降低,表明VdSho1参与响应外部高渗透信号,调节黑色素合成。分析细胞膜通透性与穿透的关系,结果显示VdSho1参与响应细胞膜透性调节剂制霉菌素刺激,调节穿透水平及黑色素含量。分析VdSho1跨膜结构域响应细胞膜通透性功能,结果显示VdSho1跨膜结构域是响应膜透性变化、调控黑色素水平所必须的。以上结果表明VdSho1参与感受细胞膜通透性变化,调节穿透和黑色素水平。4.棉花接菌实验显示,VdSho1基因敲除突变体对棉花的致病力及定殖能力显著降低,表明VdSho1调节病原菌致病性。扫描电子电镜观察ΔSho1突变体侵染棉花根部表型,ΔSho1突变体较野生型进入寄主根内部水平显著降低。分析在大丽轮枝菌侵染进程中VdSho1基因表达情况,VdSho1基因在侵染早期诱导表达,表明VdSho1是重要的致病相关基因。综上所述,VdSho1作为膜感受器参与感应细胞内外渗透压变化,进而通过调节菌丝内部黑色素的水平而提高病原菌穿透能力,最终调节大丽轮枝菌致病性。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 引言
•   1.2 大丽轮枝菌致病机理研究进展
•   1.3 病原真菌细胞表面感受器研究进展
•     1.3.1 信号黏性蛋白及其信号传导通路
•     1.3.2 跨膜蛋白Sho1及信号传导通路
•     1.3.3 G蛋白偶联受体及其信号传导通路
•   1.4 病原真菌MAPK信号通路研究进展
•   1.5 病原真菌黑色素
•     1.5.1 DHN-黑色素生物合成及调节机制研究
•     1.5.2 DHN黑色素合成抑制剂
•     1.5.3 病原真菌黑色素的功能
•   1.6 本研究的目的与意义
• 第二章 大丽轮枝菌VdSho1调控纤维素膜穿透的功能分析
•   2.1 实验材料、试剂和仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 大丽轮枝菌的培养
•     2.2.2 基因敲除转化子构建
•     2.2.3 VdSho1基因回补转化子构建
•     2.2.4 纤维素膜穿透分析
•     2.2.5 纤维素膜穿透过程转录组分析
•     2.2.6 黑色素合成水平分析
•     2.2.7 黑色素合成抑制剂处理分析
•     2.2.8 透射电镜观察纤维素穿透进程
•     2.2.9 生长表型观察
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 VdSho1基因敲除及其功能回补菌株获得
•     2.3.2 VdSho1调控纤维素膜穿透功能鉴定
•     2.3.3 纤维素膜穿透过程VdSho1调控基因分析
•     2.3.4 VdSho1调控纤维素膜穿透过程黑色素合成基因分析
•     2.3.5 黑色素调节纤维素膜穿透过程分析
•     2.3.6 Mo Sho1与VdSho1 功能同源性分析
•   2.4 讨论
• 第三章 VdSho1下游互作元件的发掘和功能分析
•   3.1 实验材料、试剂和仪器
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 酵母双杂交
•     3.2.2 转录组测序分析互作蛋白Vst50功能
•     3.2.3 Vst50/ΔSho1 回补转化子构建
•     3.2.4 VdSho1/ΔVst50 回补转化子构建
•     3.2.5 纤维素膜穿透分析
•     3.2.6 黑色素合成水平分析
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 酵母双杂交分析VdSho1与下游元件互作情况
•     3.3.2 VdSho1与VdVst50 互作区域分析
•     3.3.3 转录组测序分析纤维素膜穿透过程VdVst50功能
•     3.3.4 大丽轮枝菌VdVst50和VdSho1 调节黑色素及穿透的遗传关系分析
•     3.3.5 酵母双杂交分析VdVst7、VdVst11、VdVst50 间的互作关系
•     3.3.6 VdVst7、VdVst11 调控纤维素膜及黑色素合成的功能分析
•     3.3.7 VdSho1 调控MAPK元件转录水平
•   3.4 讨论
• 第四章 VdSho1调控纤维素膜穿透功能结构域分析
•   4.1 实验材料、试剂和仪器
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 VdSho1功能片段缺陷突变体构建
•     4.2.2 纤维素膜穿透分析
•     4.2.3 黑色素合成水平分析
•   4.3 实验结果
•     4.3.1 VdSho1结构域缺失突变体转化子鉴定
•     4.3.2 VdSho1调控纤维素膜穿透功能结构域分析
•   4.4 讨论
• 第五章 VdSho1信号响应分析
•   5.1 实验材料、试剂和仪器
•   5.2 实验方法
•     5.2.1 纤维素膜穿透分析
•     5.2.2 黑色素合成水平分析
•   5.3 实验结果
•     5.3.1 VdSho1响应甘油信号的功能分析
•     5.3.2 VdSho1响应细胞内部渗透压变化的功能分析
•     5.3.3 VdSho1跨膜结构域响应细胞膜透性变化功能分析
•   5.4 讨论
• 第六章 大丽轮枝菌跨膜蛋白VdSho1致病性功能分析
•   6.1 实验材料、试剂和仪器
•   6.2 实验方法
•     6.2.1 大丽轮枝菌接种棉花的致病表型鉴定
•     6.2.2 无菌棉侵染实验
•     6.2.3 扫描电镜观察实验
•   6.3 实验结果
•     6.3.1 大丽轮枝菌侵染棉花过程VdSho1表达模式分析
•     6.3.2 VdSho1基因敲除及功能回补菌株侵染棉花致病性表型鉴定
•   6.4 讨论
• 第七章 全文总结
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 博士论文

作者: 李俊娇

导师: 戴小枫

关键词: 大丽轮枝菌,膜感受器,黑色素合成,穿透能力,致病力

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,农业基础科学,植物保护

单位: 中国农业科学院

分类号: S432.44

DOI: 10.27630/d.cnki.gznky.2019.000026

总页数: 104

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