自裂解型人工适体核酶的设计及其在枯草芽胞杆菌基因表达中的应用

论文摘要

枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）作为一种重要的革兰氏阳性菌,在工业生物技术以及合成生物学领域被广泛用于代谢工程、重组蛋白表达以及用作新型疫苗的运载体,是一种极具应用前景的新型合成生物学底盘。目前在B.subtilis中所使用的基因表达调控元件有限,主要是组成型或诱导型启动子以及终止子等,高精准性的人工调控工具较少,并且这类元件易受到底盘细胞内源遗传系统的干扰,影响基因线路的功能。因此亟待开发新的基因调控工具以充分挖掘B.subtilis在合成生物学中的应用。RNA分子元件的调节不依赖底盘细胞自身的反式作用因子,因此具有良好的正交性,有较大的应用潜力。本研究成功地在B.subtilis中构建出了基于核酶和人工适体域的适体核酶分子开关,实现了对外源基因的调控,并系统考察了这一元件在不同遗传环境中的性能。具体研究结果如下:（1）以B.subtilis为宿主,验证曼氏血吸虫锤头状核酶的功能,证明其可用性。据此构建了表达质粒pP43RZGFP,利用核酶调控报告基因GFP的表达,检测茶碱及DMSO对核酶功能的影响。结果显示,含有核酶元件RZ的枯草芽胞菌株PBP43RZGFP表达GFP的荧光强度为118 083±7 365 a.u.,而在RZ元件失活的菌株PBP43inRZGFP中,荧光强度仅为22 048±109 a.u.,表明RZ元件能够在B.subtilis中调控GFP的表达。同时,发现添加DMSO后,PBP43RZGFP的荧光强度有所提高,而添加了茶碱后,荧光强度降低。（2）将茶碱适体域融合到锤头状核酶RZ的茎环III部位,对连接茶碱适体域和核酶的通信模块进行建库筛选,构建出受茶碱调控的一系列人工适体核酶,对其中33个突变株进一步研究。使用WHBS参数分析适体核酶结构特征和调控性能之间的量化关系,结果显示,本底荧光强度和WHBS参数显著相关,表明可根据WHBS参数对适体核酶进行理性设计;另外,BG8（5’-GGT-32 nt-TCT-3’）相比其他突变体,诱导率最高,因此将该适体核酶命名为AZ进行后续研究。（3）系统鉴定了适体核酶AZ与不同启动子的适配性并以核糖开关介导的基因调控作为比较。将6种启动子PrpoB、Pylbp、PspoVG、PminC、PsigW、PyqeZ分别与AZ和E进行适配,考察两者调控异源基因表达的性能。发现由适体核酶和启动子匹配构成的表达调控元件中,AZ与启动子PrpoB适配后（rpoBAZ）诱导率最高,达到了6.2。而核糖开关E和启动子PsigW构成的表达调控组件（sigWE）对GFP表达的诱导率最高,达到16.8。尽管核糖开关的诱导率高于适体核酶,但是适体核酶的本底表达更低,表明适体核酶对于基因表达调控更加严谨。（4）为了进一步考察这两种RNA调控元件的应用范围,将适体核酶和核糖开关与不同的外源蛋白进行匹配,分析适体核酶和核糖开关调控mCherry、普鲁兰酶、纳豆激酶表达的性能。研究发现,核糖开关E构成的调控元件sigWE介导mCherry的诱导率最高（诱导率=9.2）;与此类似,P43E调控元件介导的普鲁兰酶的诱导率最高（诱导率=32.8）,产酶水平达到81 U·mL-1。适体核酶调控元件P43AZ介导的纳豆激酶诱导率最高（诱导率=2.9）。结果确证适体核酶和核糖开关对mCherry、普鲁兰酶和纳豆激酶均能实现调控。本文成功构建了可用于基因表达调控的人工适体核酶,并将适体核酶与核糖开关的调控性能进行了比较。发现适体核酶调控的严谨性好,本底表达较低,而核糖开关的调控范围大,诱导率高。本研究为在枯草芽胞杆菌中利用调控严谨的适体核酶设计复杂的遗传线路提供了依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
•   1.1 枯草芽胞杆菌蛋白表达系统及其应用
•     1.1.1 枯草芽胞杆菌蛋白表达系统概述
•     1.1.2 枯草芽胞杆菌蛋白表达系统的调控元件
•   1.2 RNA调控元件概述及其应用
•     1.2.1 核糖开关的简介
•     1.2.2 核糖开关的研究进展
•     1.2.3 核酶的简介
•     1.2.4 适体核酶的简介
•     1.2.5 适体核酶的研究进展
•   1.3 普鲁兰酶概述及其应用
•     1.3.1 普鲁兰酶简介
•     1.3.2 普鲁兰酶的研究进展
•   1.4 纳豆激酶的概述及应用
•     1.4.1 纳豆激酶的简介
•     1.4.2 纳豆激酶的研究进展
•   1.5 本论文研究意义与内容
• 第二章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 菌株和质粒
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要仪器
•     2.1.4 培养基
•     2.1.5 主要溶液
•   2.2 重组蛋白的克隆和表达
•     2.2.1 细菌质粒的提取
•     2.2.2 基因扩增
•     2.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
•     2.2.4 重组蛋白表达菌株的构建
•     2.2.5 茶碱适体核酶通信模块文库的构建和筛选
•     2.2.6 含有检验蛋白菌株的构建
•     2.2.7 B.subtilis168 感受态细胞的制备及化学转化
•     2.2.8 重组菌株的培养
•   2.3 分析方法
•     2.3.1 SDS-PAGE分析
•     2.3.2 绿色荧光蛋白GFP和红色荧光蛋白mCherry的检测
•     2.3.3 普鲁兰酶活性检测
•     2.3.4 纳豆激酶活性检测
• 第三章 结果与讨论
•   3.1 曼氏血吸虫锤头状核酶（RZ）调控功能的验证
•     3.1.1 含有曼氏血吸虫锤头状核酶（RZ）的蛋白表达质粒的构建
•     3.1.2 核酶RZ在 B.subtilis中调控功能的验证
•     3.1.3 DMSO和茶碱对核酶（RZ）功能的影响
•   3.2 适体核酶（AZ）介导的基因调控在枯草芽胞杆菌中的应用
•     3.2.1 含有适体核酶的基因工程菌株的构建
•     3.2.2 茶碱适体核酶通信模块突变体文库的构建和筛选
•   3.3 适体核酶元件对不同启动子的适配性鉴定及作用条件的优化
•     3.3.1 TSS与适体核酶元件之间的距离对适体核酶功能的影响
•     3.3.2 茶碱配体的剂量对适体核酶调控作用的分析
•     3.3.3 适体核酶与不同内源组成型启动子的适配及调控功能鉴定
•   3.4 适体核酶和核糖开关调控外源蛋白的表达性能
•     3.4.1 适体核酶和核糖开关调控mCherry的表达性能
•     3.4.2 茶碱适体核酶和核糖开关调控元件对普鲁兰酶的调控性能
•     3.4.3 茶碱适体核酶和核糖开关调控元件对纳豆激酶的调控性能
• 主要结论与展望
•   主要结论
•   展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录 A:通信模块筛选获得的突变体的最小自由能
• 附录 B:作者在攻读硕士学位期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 缪胜男

导师: 周哲敏

关键词: 适体核酶,核糖开关,枯草芽胞杆菌,基因调控

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 江南大学

分类号: Q78;Q814

总页数: 48

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