辽宁省医疗器械检验检测院辽宁沈阳110179
【摘要】目的：通过对食管癌与癌旁组织比较蛋白质组的研究，寻找癌与癌旁差异蛋白表达，为挖掘食管癌发生相肿瘤标志物及体外诊断试剂奠定基础。方法：收集新鲜食管癌标本，根据病理诊断结果分为高分化癌组、中分化癌组和低分化癌组，以癌旁5cm以外食管粘膜作为对照。提取组织总蛋白，进行双向电泳，对比和差异分析，比较和挖掘癌与癌旁组织之间表达差异点。将这些差异蛋白点进行肽指纹图分析及网上数据库鉴定。结果：上调蛋白5个，下调蛋白5个；结论：成功鉴定出COMT为食管癌潜在体外诊断试剂指标。
【关键词】食管癌；蛋白质组学；双向电泳；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱
前言
食管癌（EsophagealCaner，EC）是由食管粘膜上皮或腺体发生的恶性肿瘤。尽管在西方国家食管癌的发病率较低，但在世界范围内亚洲、南非、东非和法国的西北部发病率都比较高[1]。食管癌主要有两种组织学类型，食管鳞状细胞癌和（Esophagealsquamouscellcarcinoma，ESCC）和食管腺癌（Esophagealadenocarcinoma，EAC），在高发区，发病的主要类型是鳞状细胞癌。现知人体内真正发挥作用的是蛋白质，欲了解食管肿瘤的发病机制、进展以及转移需要对该肿瘤蛋白的分子机制进行详细的分析。近年来在寻找食管肿瘤相关蛋白方面做了一些研究，多是是针对单个致病基因和蛋白质进行研究，缺乏整体的研究，而蛋白质的功能往往是多种蛋白质共同作用的结果。1994年由澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams首先提出了蛋白质组（Proteome）的概念，它源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合，其定义为在一种细胞内存在的全部蛋白质。基因组（genome）包含的遗传信息经转录产生mRNA，一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的mRNA称为转录子组（transcriptome）。很显然，不同细胞在不同生理或病理状态下转录子组包含的mRNA的种类不尽相同。MRNA经翻译产生蛋白质，一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质称为蛋白质组（proteome）。同理，不同细胞在不同生理或病理状态下所表达的蛋白质的种类也不尽相同。蛋白质是基因功能的实施者，因此对蛋白质结构，定位和蛋白质-蛋白质相互作用的研究将为阐明生命现象的本质提供直接的基础。蛋白质组学的研究试图比较细胞在不同生理或病理条件下蛋白质表达的异同，对相关蛋白质进行分类和鉴定[8]。更重要的是蛋白质组学的研究要分析蛋白质间相互作用和蛋白质的功能。本研究采用2-DE分离技术[6]为了保证分析过程的精确性和重复性，大规模样品处理机器人也被应用。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1组织标本采集中国医科大学第一附属医院食管癌手术样本5对、10个样本（每例包括癌组织及癌旁5cm非癌组织）。所有样本均经HE染色病理确诊为鳞癌（高、中、低分化）且在术前均未经过任何的放疗和化疗。
1.1.2主要试剂和仪器溶液A：10%的TCA-丙酮溶液；溶液B：丙酮；白抽提液（依样品不同而略有改变）：8M尿素、4%CHAPS、0.5-2%两性电解质（PH3.5-9.5）、40mMTrisbasepH8.5；PMSF、EDTA、DTT；试剂A：考马斯亮蓝G-250原液；剂B：0.01%考马斯亮蓝G-250测定工作液；0.1N盐酸和ddH2O（新鲜备制，浓盐酸稀释120倍）；白标准液。
主要仪器包括：钵、纱袋、铁锤、药匙、电子天平、瓷研钵或金属研钵、旋涡混和器、超声仪（SONICS）、高速离心机、分光光度计、低温冰箱、真空干燥仪、0.5ml离心管、1.5ml离心管、液氮；15mm×150mm试管；分光光度计；5ml、1ml、100μl、10μl取液枪。
1.2方法
1.2.1三氯醋酸-丙酮沉淀法（TCA/acetoneprecipitation）进行组织全蛋白蛋白的提取，改良的Bradford法测定蛋白样品的蛋白浓度，双向电泳进行蛋白分离。
1.2.2硝酸银染色
固定：30min或者更长时间（40%乙醇，10%冰醋酸，加水至250ml）；致敏：30min，（7530%乙醇，28.2g三水乙酸钠，0.5g硫代硫酸钠，加水到终体积250ml）；水洗30分钟后银染20分钟（0.625gAgNO3，100μl37%甲醛，加水到终体积250ml）；水洗：2×1min；显色（视情况而定，6.25gNa2CO3，50μl37%甲醛，加水到终体积250ml）；终止（10min，3.65gEDTA.Na2.2H2O或者1g甘氨酸，加水到终体250ml）。银染后扫描仪扫描。
1.2.3ImageMaster2Dplatinum软件分析胶图
已经扫描好的2-DE胶图使用ImageMaster2Dplatinum软件（使用产权属于瑞士生物信息研究所）进行分析，将分析出来的食管癌与癌旁组织差异蛋白点在胶图上切下来，经MALDI-TOF质谱鉴定后，在SWISS-PROT数据库中进行蛋白点的质普鉴定。
2.结果
1.质普结果食管癌与癌旁组织相比较，鉴定出来的上调蛋白5个，下调蛋白5个。
表1食管癌组织中鉴定出的上调蛋白
图1MALDI-TOFMS鉴定COMT蛋白，是ID号219号蛋白点的肽质量指纹图
3.讨论
COMT，是一种重要的II相酶催化的甲基转移到含有儿茶酚底物分子S-腺苷甲硫氨酸，是一种具有邻-甲基转移酶活性的代谢酶，在前列腺癌[2]，在阿尔茨海默病[3]，精神分裂症[4]的比较蛋白质组的研究中发现有上调。WesmillerSW，等[5]在乳腺癌术后恶心呕吐的研究中发现，COMT与乳腺癌术后的恶心呕吐相关。deDiego-BalaguerR等[6]发现，COMTVal158Met基因多态性能够延缓亨廷顿疾病进展。
在肿瘤研究中，SakK[7]研究表明COMT基因Val158Met基因变异导致数倍的减少酶的活性的积累可能致癌的内源性儿茶酚雌激素和活性中间体相互作用，从而提高肿瘤的发生风险。WuW[8]等研究表明，COMT抑制胰腺癌中高表达，预测生存时间更长。与PI3K/Akt信号通路的相互作用使得COMT基因治疗的潜在靶点。本研究结果表明COMT在食管癌中上调，推测COMT蛋白的上调可能与食管癌的发生、发展、代谢、转移等有关，为潜在的食管癌体外诊断试剂指标。本研究下一步将采用少量临床组织样本进行mRNA水平、蛋白水平的进一步确证。
参考文献：
[1]LiY，，LiX，，KanQ，etal.MitochondrialpyruvatecarrierfunctionisnegativelylinkedtoWarburgphenotypeinvitroandmalignantfeaturesinesophagealsquamouscellcarcinomas.Oncotarget.2016Nov30.
[2]BrureauL，MoningoD，EmevilleE，etal.PolymorphismsofEstrogenMetabolism-RelatedGenesandProstateCancerRiskinTwoPopulationsofAfricanAncestry.PLoSOne.2016Apr13；11（4）：e0153609.
[3]YanW，ZhaoC，SunL，etal.AssociationbetweenpolymorphismofCOMTgene（Val158Met）withAlzheimer'sdisease：Anupdatedanalysis.JNeurolSci.2016Feb15；361：250-5.
[4]DemilyC，Louchart-de-la-ChapelleS，NkamI，etal.DoesCOMTval158metpolymorphisminfluenceP50sensorygating，eyetrackingorsaccadicinhibitiondysfunctionsinschizophrenia?PsychiatryRes.2016Oct27.pii：S0165-1781（16）30107-X.
[5]WesmillerSW，SereikaSM，BenderCM，etal.Exploringthemultifactorialnatureofpostoperativenauseaandvomitinginwomenfollowingsurgeryforbreastcancer.AutonNeurosci.2016Sep28.
[6]angavantL，YoussovK，VernyC，etal.COMTVal158MetPolymorphismModulatesHuntington'sDiseaseProgression.PLoSOne.2016Sep22；11（9）：e0161106
[7]SakK.TheVal158MetpolymorphisminCOMTgeneandcancerrisk：roleofendogenousandexogenouscatechols.DrugMetabRev.2016Nov23：1-28.
[8]WuW，WuQ，HongX，etal.Catechol-O-methyltransferase，anewtargetforpancreaticcancertherapy.CancerSci.2015May；106（5）：576-83.
作者简介：
刘赞，（1976-），女，辽宁沈阳人，博士，主要研究方向为1.肿瘤的发病机制研究及早期体外诊断试剂的探测2.分子水平进行医疗器械生物学毒性评估。