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酰基辅酶A结合蛋白在红曲霉红曲色素合成代谢中的研究

2020-12-08阅读(321)

酰基辅酶A结合蛋白在红曲霉红曲色素合成代谢中的研究

论文摘要

红曲古代称丹曲,在我国有1000多年历史,它是以大米为原料,接种红曲霉发酵而成的红曲色素,属于天然可食用色素。红曲色素的化学结构由聚酮发色团和脂肪酸链两部分组成。酰基辅酶A结合蛋白（ACBP）作为高度保守蛋白,存在于真核生物和原核生物中,主要参与脂肪酸代谢。本论文主要对红曲霉CICC41233中2个ACBP（MrACBP）编码基因开展与红曲色素合成相关研究,取得的主要结果:（1）Mracbp基因克隆:以红曲霉CICC41233总DNA和cDNA为模板,PCR扩增得到Mracbp基因。经测序后分析Mracbp1 DNA序列全长629 bp,RNA序列全长450 bp,有2个内含子,编码149个氨基酸,预测分子量16 kDa,NCBI核酸Blast比对与Aspergillus vadensis CBS 113365 ACBP-domain-containing protein（BO88DRAFT483611）（XM025712234.1）同源性73.97%,蛋白质Blast比对与Aspergillus sclerotiicarbonarius CBS 121057（PYI08169.1）ACBP同源性37.21%。Mracbp2 DNA序列全长1525 bp,RNA序列全长1329 bp,有3个内含子,编码442个氨基酸,预测分子量51 kDa,NCBI核酸Blast比对与Aspergillus nomius NRRL 13137 acyl CoA binding protein（ANOM009680）（XM015554936.1）同源性72.59%,蛋白质Blast比对与Aspergillus nomius NRRL 13137（XP015401904.1）ACBP同源性72.11%。（2）重组蛋白与底物脂酰辅酶A结合能力测定:将不含内含子的Mracbp1构建于原核表达载体pMAL-c4X,转化大肠杆菌E.coli Rosetta DE3菌株,IPTG诱导目的蛋白大量表达,纯化后获得MBP-MrACBP1融合蛋白,微量热泳动结合实验表明与C14:0脂酰辅酶A结合能力最强。将不含内含子的Mracbp2构建于原核表达载体pGEX-6p-1,转化大肠杆菌E.coli BL21菌株,IPTG诱导表达目的蛋白,纯化后获得GST-MrACBP2融合蛋白,微量热泳动结合实验表明与C16:0脂酰辅酶A结合能力最强。（3）Mracbp在红曲霉CICC41233中过表达产红曲色素分析:构建Mracbp1基因表达载体pNeo0380-gpdA-acbp1和Mracbp2基因表达载体pNeo0380-gpdA-acbp2,农杆菌Ti质粒介导转化红曲霉CICC41233,分别获得工程菌株红曲霉ACBP5和红曲霉ACBP-E。相比红曲霉CICC41233,红曲霉ACBP5发酵6 d,红曲色素产量提高12.70%。发酵2 d,荧光定量PCR结果显示acbp1和红曲色素合成基因簇中pks、mppr1、fasA、fasB基因表达分别上调77.39倍、6.41倍、3.21倍、3.42倍、4.41倍。红曲霉ACBP-E发酵6 d,红曲色素产量提高37.73%。发酵2 d,荧光定量PCR结果显示acbp2和红曲色素合成基因簇中pks、mppr1、fasA和fasB基因表达分别上调1.74倍、2.7倍、2.51倍、2.20倍、3.11倍。（4）红曲霉CICC41233中acbp2基因敲除:为提高红曲霉基因敲除效率,构建DNA ligase IV（ligD）基因敲除载体,农杆菌Ti质粒介导转化红曲霉CICC41233,获得突变体菌株红曲霉△ligD。在此基础上,农杆菌Ti质粒介导将构建的Mracbp2基因敲除载体转化红曲霉△ligD,挑选50个转化子进行筛选验证但并未得到成功敲除acbp2基因的红曲霉突变体菌株。（5）Mr ACP蛋白表达与纯化:在酰基载体蛋白（ACP）编码基因终止密码子前引入His标签蛋白,连接于原核表达载体pMAL-c4X中,构建MBP+His双标签蛋白表达系统,转化大肠杆菌E.coli Rosetta DE3菌株,IPTG诱导目的蛋白大量表达,镍柱纯化后获得MBP-MrACP-His融合蛋白。本论文探究了ACBP对红曲色素合成的影响,为提高红曲色素的产量提供新思路,为构建高产红曲色素的工程菌株提供新方向。

论文目录

  • 摘要
  • abstract
  • 第一章 前言
  •   1.1 红曲功能研究
  •   1.2 红曲霉红曲色素国内外研究进展
  •   1.3 酰基辅酶A结合蛋白介绍
  •     1.3.1 酰基辅酶A结合蛋白结构分析
  •     1.3.2 酰基辅酶A结合蛋白功能研究
  •   1.4 本课题研究意义
  • 第二章 红曲霉酰基辅酶A结合蛋白基因克隆
  •   2.1 引言
  •   2.2 材料和方法
  •     2.2.1 供试菌株
  •     2.2.2 主要材料和仪器设备
  •     2.2.3 实验所用培养基及试剂配制方法
  •     2.2.4 实验方法
  •   2.3 结果
  •     2.3.1 红曲霉CICC41233 cDNA文库构建
  •     2.3.2 基因克隆
  •     2.3.3 Mracbp基因片段测序结果分析
  •     2.3.4 生物信息学分析
  •   2.4 讨论
  • 第三章 红曲霉酰基辅酶A结合蛋白原核表达及功能鉴定
  •   3.1 引言
  •   3.2 材料和方法
  •     3.2.1 主要材料和仪器设备
  •     3.2.2 实验所用培养基及试剂配制方法
  •     3.2.3 实验方法
  •   3.3 结果
  •     3.3.1 原核表达载体构建
  •     3.3.2 重组蛋白诱导表达
  •     3.3.3 重组蛋白纯化
  •     3.3.4 重组蛋白功能鉴定
  •   3.4 讨论
  • 第四章 Mracbp过表达对红曲霉产红曲色素的影响
  •   4.1 引言
  •   4.2 材料和方法
  •     4.2.1 主要材料和仪器设备
  •     4.2.2 实验所用培养基及试剂配制方法
  •     4.2.3 实验方法
  •   4.3 结果
  •     4.3.1 过表达载体构建
  •     4.3.2 工程菌株筛选
  •     4.3.3 工程菌株与野生菌株发酵结果分析
  •     4.3.4 工程菌株与野生菌株的相关基因表达量分析
  •     4.3.5 脂肪酸含量检测
  •   4.4 讨论
  • 第五章 红曲霉acbp2 基因敲除
  •   5.1 引言
  •   5.2 材料和方法
  •     5.2.1 供试菌株
  •     5.2.2 主要材料和仪器设备
  •     5.2.3 实验所用培养基及试剂配制方法
  •     5.2.4 实验方法
  •   5.3 实验结果
  •     5.3.1 p0380-Hph-ligD敲除载体构建
  •     5.3.2 突变体菌株筛选
  •     5.3.3 p0380-Neo-acbp2 敲除载体构建
  •     5.3.4 acbp2 突变体菌株筛选
  •   5.4 讨论
  • 第六章 酰基载体蛋白原核表达和纯化
  •   6.1 引言
  •   6.2 材料和方法
  •     6.2.1 主要材料和仪器设备
  •     6.2.2 实验所用培养基及试剂配制方法
  •     6.2.3 实验方法
  •   6.3 结果
  •     6.3.1 基因克隆
  •     6.3.2 原核表达载体构建
  •     6.3.3 诱导表达目的蛋白
  •     6.3.4 目的蛋白纯化
  •   6.4 讨论
  • 第七章 结论与展望
  •   7.1 结论
  •   7.2 展望
  • 参考文献
  • 附录
  •   附录1 实验用药品和试剂
  •   附录2 实验用主要仪器
  •   附录3 以DNA为模板扩增的基因测序序列
  •   附录4 以cDNA为模板扩增的基因测序序列
  •   附录5 用于ACBP1 系统发育树分析的物种氨基酸序列
  •   附录6 用于ACBP2 系统发育树分析的物种氨基酸序列
  • 攻读硕士学位期间的研究成果及所获得的荣誉
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 刘梦梦

    导师: 曾斌,龙传南

    关键词: 红曲霉,酰基辅酶结合蛋白,脂肪酸,原核表达,微量热涌动技术

    来源: 江西科技师范大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

    专业: 生物学,一般化学工业

    单位: 江西科技师范大学

    基金: 国家自然科学基金(NSFC31460447,NSFC31171731),国家自然科学基金委地区基金(31860436),江西省科技厅自然科学面上项目(20181BAB204001),江西科技师范大学青年拔尖人才项目(2018QNBJRC004),江西省教育厅科学技术研究项目(GJJ170676),江西省科技厅青年科学基金(20161BAB214177)

    分类号: TQ925.7;Q78

    DOI: 10.27751/d.cnki.gjxkj.2019.000142

    总页数: 119

    文件大小: 2996K

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