放线菌磷源感知转录调控因子介导的营养代谢网络研究

论文摘要

微生物是地球上多变性及适应性最强的有机体,特别是细菌,它们已演化出多种复杂而精密的信号转导途径以应对与适应不断变化的外界环境。其中以放线菌为例的原核生物细胞主要采用组氨酸和天冬氨酸磷酸化的双组分信号系统来感应生存条件中各种不同信号,并迅速将信号传至菌体内,从而启动一系列相关基因的转录、翻译及翻译后修饰,发挥相应的生物学调控功能。鉴于磷是生物体中参与中心能量代谢、翻译后修饰以及各类物质合成的必要元素,我们以耻垢分枝杆菌（Mycobacteriu smegmatis）和红霉糖多孢菌（Saccheropolyspora erthraea）为代表研究磷源感知及代谢在放线菌中的重要作用与意义。一方面,我们发现M.smegmatis中的磷源感知调控蛋白RegX3是菌体耐受高浓度短链脂肪酸丙酸盐所必需的,能够通过激活PrpR调节子来促进甲基柠檬酸循环的进行,并进一步引发菌体形态的变化以维持其在巨噬细胞低磷环境中的代谢平衡与生长存活。这为治疗以结核分枝杆菌为典型代表的致病性放线菌提供了潜在的药物靶点。另一方面,我们分析了S.erythraea中磷代谢全局调控因子PhoP对两种S-腺苷甲硫氨酸（SAM）合成同工酶编码基因的调控,证实PhoP直接诱导其中更为重要的SACE3900 SAM合成酶并促进SAM的形成,为红霉素生物合成的关键步骤（红霉素C到红霉素A的转换）提供充足的甲基基团,从而提高红霉素的质量与产量。同样地,氮代谢全局调控因子GlnR具有相同的调控模式。这为提高工业稀有放线菌的应用价值和经济效益提供了新思路。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
•   1.1 放线菌简介
•     1.1.1 分枝杆菌及其危害
•     1.1.2 结核病研究模型——耻垢分枝杆菌
•     1.1.3 链霉菌及其应用
•     1.1.4 红霉素生产者-红霉糖多孢菌
•   1.2 放线菌磷源感知及代谢调控的研究现状
•     1.2.1 磷源感知及代谢调控的分子机制
•     1.2.2 磷代谢全局调控因子的研究进展
•   1.3 磷代谢调控对重要生理过程的影响
•     1.3.1 与其他营养代谢的相互作用
•     1.3.2 对菌体形态的影响
•     1.3.3 对次级代谢的影响
•   1.4 本论文的研究目的及意义
• 第2章 耻垢分枝杆菌中磷源感知转录调控因子RegX3对甲基柠檬酸循环的调控研究
•   2.1 引言
•   2.2 实验原理
•   2.3 实验材料
•     2.3.1 菌株与质粒
•     2.3.2 试剂与耗材
•     2.3.3 实验仪器
•     2.3.4 培养基及溶液
•   2.4 实验方法
•     2.4.1 调控蛋白靶基因预测
•     2.4.2 regX3与prpR基因的克隆与表达
•     2.4.3 凝胶阻滞实验（EMSAs）
•     2.4.4 M.smegmatis regX3敲低和过表达菌株的构建
•     2.4.5 基因转录分析
•     2.4.6 甲基柠檬酸合成酶（MCS）的酶活测定动力学结合分析
•     2.4.7 Octet实验
•     2.4.8 细胞侵染实验
•     2.4.9 细菌形态观察实验
•   2.5 结果与讨论
•     2.5.1 M.smegmatis RegX3、PrpR及PrpDBC的进化分析
•     2.5.2 M.smegmatis RegX3直接结合prpR基因调控区
•     2.5.3 M.smegmatis RegX3通过促进PrpR表达来激活甲基柠檬酸循环
•     2.5.4 RegX3是M. smegmatis利用丙酸盐所必需的
•     2.5.5 RegX3响应磷源水平调控丙酸盐代谢
•     2.5.6 RegX3对prpR的调控受PrpR表达的影响
•     2.5.7 RegX3促进M.smegmatis在巨噬细胞内的存活
•     2.5.8 RegX3影响着丙酸盐中M.smegmatis的生长形态
•     2.5.9 磷源感知调控因子RegX3调控PrpR在M.tuberculosis中保守
•   2.6 本章小结
• 第3章 红霉糖多孢菌中磷源感知调控因子PhoP调控的SAM依赖性红霉素合成过程研究
•   3.1 引言
•   3.2 实验原理
•   3.3 实验材料
•     3.3.1 质粒和菌株
•     3.3.2 实验试剂
•     3.3.3 实验仪器
•     3.3.4 培养基及溶液
•   3.4 实验方法
•     3.4.1 调控蛋白靶基因预测
•     3.4.2 glnR与phoP基因的克隆与表达
•     3.4.3 凝胶阻滞实验（EMSAs）
•     3.4.4 S.erythraea phoP过表达及glnR敲除、回补、过表达菌株的构建
•     3.4.5 基因转录分析
•     3.4.6 HPLC平台测定胞内SAM含量
•     3.4.7 HPLC平台测定培养液中红霉素组分A和C含量
•     3.4.8 抑菌圈实验评估红霉素效价
•   3.5 结果与讨论
•     3.5.1 S.erythraea SAM合成酶的生物信息学分析
• 3900）上游调控区'>    3.5.2 营养调控因子PhoP直接结合SAM合成酶基因（SACE₃900）上游调控区
•     3.5.3 PhoP激活SAM合成酶编码基因的表达
•     3.5.4 PhoP与氮代谢全局调控因子GlnR共同调控SAM的合成
•     3.5.5 PhoP与GlnR共同促进SAM依赖性红霉素合成
•   3.6 本章小结
• 第4章 总结与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李雨欣

导师: 叶邦策

关键词: 放线菌,磷代谢,转录调控,甲基柠檬酸循环,依赖性红霉素合成

来源: 华东理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 华东理工大学

分类号: Q933

总页数: 109

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