海洋着色菌（Marichromatium gracile）YL28生物膜的特性及其形成机理初探

论文摘要

细菌生物膜是一种结构性的细菌群落,其形成过程是多种信号因子（菌密度、光照强度、金属离子和氧浓度等）所参与的调控系统（群体感应和第二信使等）综合作用的结果。因其独特的特性和较强的适应能力,在医学、海洋生物污损以及环境治理等方面备受关注。目前应用于水体污染处理的菌株主要为淡水或陆源菌株,在培养系统中主要呈现游离状态分布,难以适应高盐环境,成膜能力较低。源自红树林的海洋着色菌（Marichromatium gracile,M.gracile）YL28能够适用于复杂水体,具有高效除氮能力,且在培养系统中成膜能力高,成膜时间较短。鉴于此,本研究优化了M.gracile YL28生物膜形成的条件,阐明其生物膜形成规律。探究单一和复合重金属离子对生物膜特性的影响,考察了在含有重金属离子的高浓度氮污染废水中生物膜的脱氮效果及对重金属离子的吸附能力。构建环二鸟苷酸（c-di-GMP）生物传感器,为深入研究不产氧光合细菌（APB）生物膜形成的调控机制奠定了基础。主要研究结果如下:·M.gracile YL28生物膜形成规律和特性研究。以脱氢酶活性为检测指标,进行了8种因子的单因素实验,利用Plackett-Burman方法筛选出3种因子进行了响应面优化。结果表明,表明光照有利于成膜,但受光照强度的影响,在适宜光强时,成膜率高达71.21%;生物膜的形成虽限制了培养器皿内部光照,但内部游离菌体的脱氢酶活性并没有降低,氨氮和亚硝氮去除活性也未受到影响,由此初步提出了APB生物膜形成规律为培养液中菌体主要在生物膜及其界面生长并游离扩散至培养液中。·单一重金属离子对生物膜特性的影响。6种重金属离子对生物膜形成、生物活性及光合色素合成有明显影响。重金属抑制M.gracile YL28光合色素的合成。在选择的浓度范围内,生物膜对重金属离子的耐受性高于游离菌体,重金属离子浓度较低时,刺激胞外蛋白和多糖的合成来抵抗胁迫,能吸附更多的重金属。·多元复合重金属离子对生物膜特性的影响及对生物膜对重金属的去除。在含有多元复合重金属离子体系,亚硝氮的去除不受影响,胞外蛋白的合成受到抑制。二元、三元重金属离子的交互作用表现为拮抗(Cu2+*Hg2+)或互作(Cu2+*Zn2+);四元、五元和六元重金属离子的交互作用多呈交互抑制作用。在含复合重金属离子（高低浓度）的无机三态氮共存的生物膜反应系统中,硝氮和亚硝氮去除不受影响（8 d）,重金属离子的去除率分别为Cd2+（55.20%,73.10%）、Cr6+（74.30%,91.10%）、Cu2+（57.60%,74.60%）、Pb2+（44.30%,90.8%）、Zn2+（38.70%,41.10%）和Hg2+（31.70%,33.80%）。实际养殖水体发现,M.gracile YL28与水体土著微生物相互作用,降低水体中的无机三态氮含量。·生物膜形成的调控机制初探。以紫硫菌M.gracile YL28为研究模型,通过基因组和关键基因的挖掘分析,初步绘制了c-di-GMP调控生物膜形成的可能代谢通路;构建了用于检测胞内的c-di-GMP水平变化的E.coil（pVLT33-FRET-YcgR）生物传感器,初步研究显示,环境因子调控c-di-GMP的合成与降解。综上所述:本研究发现该YL28菌株有高的成膜率并阐明了环境因子对生物膜形成的影响和规律,提出了新的APB菌株生物膜形成模型。阐明高成膜M.gracile YL28在单一和复合HMIs复杂环境中的生物活性和成膜机制以及膜对其吸附的规律,为全面解析环境因子对生物膜形成的影响提供了方法。M.gracile YL28生物膜初步应用在高无机三态氮模拟水中具有明显的去除作用,为生物膜反应器的开发和应用提供参考菌株,并在基因组水平上初步分析了调控机制,为进一步深入研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 缩略词中英文对照表
• 第1章 绪论
•   1.1 生物膜的研究进展
•     1.1.1 生物膜的形成模型与结构特点
•     1.1.2 群体感应对细菌生物膜形成的调节机制
•     1.1.3 群体感应淬灭对生物膜形成的抑制
•   1.2 生物膜形成的影响因素
•     1.2.1 光影响细菌生物膜的生长
•     1.2.2 金属离子影响生物膜的组成
•     1.2.3 营养条件改变细菌生物膜的结构组分
•     1.2.4 氧浓度的变化改变生物膜的特性
•     1.2.5 贴附材料为生物膜的形成提供场所
•   1.3 c-di-GMP调控细菌生物膜的形成
•     1.3.1 c-di-GMP信号传感结构域
•     1.3.2 c-di-GMP的信号传递与生物膜的形成
•     1.3.3 c-di-GMP的受体
•     1.3.4 c-di-GMP的检测方法
•   1.4 生物膜技术的研究进展
•     1.4.1 生物膜法去除污染水体中的重金属离子和无机三态氮
•     1.4.2 生物膜反应器的开发与应用
•   1.5 本课题的研究内容和创新性
•     1.5.1 本课题的研究内容
•     1.5.2 本课题的创新性
• 第2章 高成膜海洋着色菌YL28生物膜特性的探究
•   2.1 引言
•   2.2 材料与方法
•     2.2.1 材料
•     2.2.2 培养基、菌种的制备及培养
•     2.2.3 单因素实验的设计与Plackett-Burman筛选
•     2.2.4 响应面优化实验设计与验证
•     2.2.5 光照强度对生物膜活性的影响
•     2.2.6 生物膜和游离菌体无机三态氮脱除实验培养体系
•     2.2.7 生物膜和游离菌体样品的制备检测及成膜率计算
•     2.2.8 脱氢酶活性及生物膜干重的测定
•     2.2.9 胞外复合物的测定
•     2.2.10 无机三态氮的检测
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 单因素实验与P-B筛选
•     2.3.2 响应面优化法确定生物膜形成的最佳条件
•     2.3.3 优化前后菌体生物活性差异分析
•     2.3.4 优化前后生物膜脱氮功效的分析
•     2.3.5 生物膜的形成曲线
•     2.3.6 生物膜形成与菌体脱氢酶活性的测定
•     2.3.7 生物膜胞外复合物组分含量分析
•     2.3.8 生物膜与游离菌体脱氮活性的比较
•   2.4 讨论
•   2.5 小结
• 第3章 重金属离子胁迫对高脱氮海洋着色菌YL28生物膜特性的影响
•   3.1 引言
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 材料
•     3.2.2 菌种的制备及培养
•     3.2.3 重金属离子标准溶液的配制
•     3.2.4 YL28生物膜形成及其对金属离子的去除
•     3.2.5 析因实验设计
•     3.2.6 生物膜对模拟废水中重金属离子、无机三态氮和磷去除
•     3.2.7 海水养殖水体沉积物和海水样品的采集
•     3.2.8 海洋着色菌YL28对模拟海水养殖体系中氮污染的去除
•     3.2.9 生物膜样品和游离菌体样本的制备及检测
•     3.2.10 细菌光合色素含量和胞外复合物的测定
•     3.2.11 重金属离子的吸附测定
•     3.2.12 样品的测定方法
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 单一重金属离子对YL28生长的影响
•     3.3.2 单一重金属离子对YL28生物膜细菌光合色素合成总量的影响
•     3.3.3 单一重金属离子对YL28生物膜胞外复合物合成的影响
•     3.3.4 生物膜及游离菌体对单一重金属离子的吸附
•     3.3.5 复合重金属离子对海洋着色菌YL28生长的影响
•     3.3.6 多种重金属离子对海洋着色菌YL28组分间生物膜差异分析
•     3.3.7 重金属离子对海洋着色菌YL28联合毒性分析
•     3.3.8 海洋着色菌YL28生物膜反应器脱氮功效
•     3.3.9 海洋着色菌YL28对模拟海水养殖体系中氮污染的去除
•   3.4 讨论
•   3.5 小结
• 第4章 海洋着色菌YL28生物膜形成机制的探究
•   4.1 引言
•   4.2 材料与方法
•     4.2.1 菌株和质粒
•     4.2.2 仪器和试剂
•     4.2.3 主要试剂的配制
•     4.2.4 培养基及培养条件
•     4.2.5 重组E.coli（pVLT33-mCerulean-YcgR-mVenus）的构建
•     4.2.6 mCerulean-YcgR-mVenus蛋白的纯化与鉴定
•     4.2.7 pH对E.coli BL21重组子c-di-GMP合成的影响
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 海洋着色菌YL28基因组数据挖掘及关键基因的功能分析
•     4.3.2 E.coli BL21基因组DNA检测和基因YcgR PCR退火温度的探究
•     4.3.3 YcgR和pVLT33-mCerulean-mVenus质粒的检测
•     4.3.4 重组载体pVLT33-mCerulean-YcgR-mVenus克隆与鉴定
•     4.3.5 mCerulean-mVenus和mCerulean-YcgR-mVenus蛋白的蛋白纯化
•     4.3.6 mCerulean-mVenus和mCerulean-YcgR-mVenus蛋白的荧光光谱
•     4.3.7 pH对E.coli BL21重组子c-di-GMP合成的影响
•   4.4 讨论
•   4.5 小结
• 第5章 结论与展望
•   5.1 结论
•   5.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 周广静

导师: 赵春贵

关键词: 海洋着色菌,生物膜,重金属离子,生物传感器,环二鸟苷酸

来源: 华侨大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,环境科学与资源利用

单位: 华侨大学

分类号: Q93;X52

总页数: 105

文件大小: 3672K

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