塞内卡病毒A（SVA）VP1与宿主BAD互作激活线粒体凋亡通路的分子机制研究

论文摘要

细胞凋亡（Apoptosis）是机体为保障自身稳态平衡通过调控基因表达使细胞发生自主有次序的死亡过程。病毒感染引起的细胞凋亡是宿主为抵御病原体复制和扩散的防御机制。如果细胞凋亡发生在子代病毒组装过程中,则宿主会利用免疫监视和防御功能及时将子代病毒吞噬并排除体外。因此很多病毒会通过某种机制来抑制宿主死亡,以期保证病毒能在宿主内稳定存活。相反,当病毒完成装配后,又会利用宿主的促凋亡机制进而扩散其子代病毒。塞内卡病毒A（Senecavirus A,SVA）是目前塞内卡病毒属唯一成员,它是无囊膜、单股正链小RNA病毒。2002年SVA初次在培养人胎儿视网膜细胞的培养基内被发现。猪作为SVA的易感动物,感染后表现为,吻突或口腔粘膜处会发生完整或破裂的小泡,并且蹄部出现水泡破裂而致使跛行。同时,新生仔猪感染SVA后会发生急性死亡。SVA作为小核糖核酸病毒科的一类新病原,感染宿主后对宿主细胞凋亡产生调控作用不清楚。通过HE染色和石蜡切片荧光TUNEL实验发现,SVA能够引起宿主组织产生明显病理变化,并出现明显的细胞凋亡。为探究SVA对宿主细胞凋亡的作用,首先通过显微镜观察,发现SVA感染能引起PK-15和HEK293T细胞产生明显的细胞病变。通过qPCR实验和流式细胞术检测发现SVA能够在293T细胞中复制,并且与对照相比SVA能显著性的诱导293T细胞凋亡。其次通过Western Blotting及流式细胞术筛选SVA各蛋白表明,SVA结构蛋白VP1具有诱导细胞凋亡功能且呈剂量依赖性。最后,为进一步探索SVA-VP1诱导细胞凋亡的分子机制,通过Annexin-V-FITC/PI染色荧光观察发现,VP1能使细胞发生早期和晚期细胞凋亡。免疫共沉淀、间接免疫荧光以及线粒体分离实验发现,SVA-VP1亚细胞定位于线粒体,并且与促凋亡蛋白BAD在线粒体上发生相互作用。通过瞬时转染BAD表明,BAD能促进VP1诱导的细胞凋亡。然而采用siRNA干扰技术敲低BAD后,VP1诱导凋亡的功能显著性降低。Western Blotting以及qPCR试验检测发现,VP1能够促进BAD及其下游蛋白BAX的表达及Caspase3的剪切活化,但对上游蛋白AKT、JNK及其的磷酸化无影响。而将BAD敲低后,VP1对BAX和Caspase3蛋白水平和mRNA水平的促进作用消失了。通过qPCR检测还发现,在SVA感染细胞后期,BAD能够促进SVA的复制。以上实验表明,VP1依赖于BAD激活线粒体凋亡通路,且BAD促进SVA复制。本研究表明,细胞在感染SVA后,通过其结构蛋白VP1与促凋亡蛋白BAD在线粒体上特异性互作,并依赖于BAD促进促凋亡蛋白BAX和Caspase3的表达及活化,最终导致细胞出现凋亡。本结果有助于揭示SVA利用宿主蛋白影响宿主细胞凋亡及自身复制的分子机制,为更深入的揭示SVA的致病机制提供理论依据。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 英文缩略表
• 第一章 引言
•   1.1 塞内卡病毒A
•   1.2 细胞凋亡的生物学意义
•   1.3 小核糖核酸病毒诱导凋亡研究进展
•   1.4 本研究目的和意义
• 第二章 SVA结构蛋白VP1具有诱导细胞凋亡的功能
•   2.1 前言
•   2.2 材料
•     2.2.1 质粒,毒株,细胞系及抗体
•     2.2.2 实验试剂及器材
•       2.2.2.1 细胞实验相关试剂和器材
•       2.2.2.2 实时荧光定量相关试剂和器材
•       2.2.2.3 免疫共沉淀及间接免疫荧光相关试剂和器材
•       2.2.2.4 Westen Blotting实验相关试剂和器材
•       2.2.2.5 细胞凋亡检测相关试剂和器材
•   2.3 方法
•     2.3.1 动物攻毒实验
•     2.3.2 石蜡切片荧光TUNEL实验
•     2.3.3 HE染色
•     2.3.4 质粒大量提取
•     2.3.5 SVA滴度的测定
•     2.3.6 细胞瞬时转染和病毒感染
•     2.3.7 荧光显微镜观察
•     2.3.8 Western Blotting
•     2.3.9 Annexin-V-FITC/PI染色
•     2.3.10 数据分析
•   2.4 实验结果
•     2.4.1 SVA感染引起猪组织病变及组织细胞凋亡
•     2.4.2 SVA感染使细胞产生病变
•     2.4.3 SVA在293T细胞中复制并引起细胞凋亡
•     2.4.4 SVA各蛋白质粒在293T细胞中表达
•     2.4.5 SVA结构蛋白VP1具有诱导细胞凋亡的功能
•     2.4.6 SVA-VP1能诱导细胞发生早期和晚期凋亡
•   2.5 讨论
• 第三章 SVA结构蛋白VP1诱导细胞凋亡的分子机制
•   3.1 前言
•   3.2 材料
•     3.2.1 质粒、细胞系及抗体
•     3.2.2 试剂及溶液配制
•     3.2.3 实验仪器
•   3.3 方法
•     3.3.1 Western Blotting
•     3.3.2 Trizol法提取总RNA
•     3.3.3 实时荧光定量PCR
•     3.3.4 免疫共沉淀
•     3.3.5 间接免疫荧光
•     3.3.6 线粒体分离
•     3.3.7 Annexin-V-FITC/PI染色
•   3.4 结果
•     3.4.1 SVA结构蛋白VP1与促凋亡蛋白BAD互作
•     3.4.2 VP1在线粒体膜上与促凋亡蛋白BAD互作
•     3.4.3 过表达BAD促进VP1诱导的细胞凋亡
•     3.4.4 BAD下调表达后抑制VP1诱导的凋亡
•     3.4.5 过表达BAD促进SVA复制
•   3.5 讨论
• 第四章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王咏

导师: 张克山

关键词: 塞内卡病毒,细胞凋亡,机制

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院

基金: 国家自然科学基金(U1501213),云南省重点研发计划项目(2018BB004)

分类号: S852.65

总页数: 47

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