荚膜在鲍曼不动杆菌感染鼠巨噬细胞中的作用研究

论文摘要

目的:鲍曼不动杆菌是临床常见耐药菌,多重/泛耐药鲍曼不动杆菌所导致的感染已成为全球关注的重要公共卫生问题,但对于鲍曼不动杆菌毒力机制研究却少见。荚膜是细菌的重要毒力因子,可以发挥保护细菌并抵抗宿主免疫细胞吞噬清除的功能,但目前尚未见鲍曼不动杆菌荚膜的毒力机制研究。本研究拟通过不同荚膜厚度鲍曼不动杆菌以及提纯的荚膜多糖与鼠巨噬细胞（Raw 264.7细胞）相互作用,探讨鲍曼不动杆菌荚膜诱导鼠巨噬细胞自噬和凋亡机制。方法:1.根据鲍曼不动杆菌和其他不动杆菌16S rRNA基因中特异性序列设计引物,建立多重PCR法鉴定鲍曼不动杆菌和其他不动杆菌。2.采用刚果红染料染色鲍曼不动杆菌,在油镜下观察鲍曼不动杆菌荚膜厚度,建立一种快速简便方法鉴别鲍曼不动杆菌荚膜厚度。挑取两株荚膜厚度差异明显的鲍曼不动杆菌,即厚荚膜株（Ab-H株）和薄荚膜株（Ab-B株）用于后续研究。3.血平板上分别培养Ab-H株和Ab-B株,经37℃培养24 h后收集血平板上菌苔。加入细菌中细菌裂解液,并结合超声裂解细菌,收集裂解后上清加入终浓度为1%三甲基十六烷基溴化铵（CTAB）溶液第一次沉淀荚膜多糖,沉淀以1 mol/L CaCl2溶液重新溶解,以80%乙醇再次沉淀荚膜多糖,沉淀最终以无水乙醇反复洗涤后即为鲍曼不动杆菌荚膜多糖提取物。所提取荚膜多糖经苯酚-浓硫酸法测定浓度,鲎试剂法检测内毒素含量,并通过LC-MS法分析荚膜多糖成分。4.分别以鲍曼不动杆菌Ab-H株和Ab-B株以及不同浓度纯化荚膜多糖与Raw264.7细胞共培养1 h、3 h和6 h,采用实时荧光定量PCR法检测共培养不同时间Raw 264.7细胞自噬相关基因Atg3、Atg4B、Atg5、Atg7、Atg12、Atg16L1、GABARAPL1和ULK1表达量,采用Western blotting法检测共培养不同时点Raw264.7细胞自噬相关蛋白LC3、Atg12、Beclin-1和凋亡蛋白Cleaved Caspase-3表达量,AnnexinV-FITC/PI法检测共培养不同时点Raw 264.7细胞凋亡率。5.分别以鲍曼不动杆菌Ab-H株和Ab-B株以及不同浓度的纯化荚膜多糖与Raw264.7细胞共培养1 h、3 h和6 h,分别采用实时定量PCR法检测共培养不同时间Raw 264.7细胞TLR2、TLR4、NLRP3和IL-1β基因表达量,流式细胞术检测活性氧（ROS）表达量,Western blotting法检测PI3K、Akt和mTOR磷酸化蛋白表达量,探讨鲍曼不动杆菌荚膜诱导Raw 264.7细胞自噬和凋亡机制。结果:1.经多重PCR法扩增,鲍曼不动杆菌可以获得两条带分别为425bp和208bp;而其他不动杆菌仅有一条为425bp。经基因测序分析208bp条带为鲍曼不动杆菌特异性条带,425bp条带为不动杆菌所共有条带,与预期一致。我院经VITEK 2Compact全自动细菌鉴定系统鉴定醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体中,98%菌种确认为鲍曼不动杆菌。2.鲍曼不动杆菌以刚果红染料染色后,油镜下可见细菌被成紫色,整个背景为淡红色,细菌荚膜不着色,极易辩识。所检测菌株中,细菌荚膜厚度并不相同,挑取两株荚膜厚度差异显著的菌株,即厚荚膜株（Ab-H）和薄荚膜株（Ab-B）用于后续研究。3.本研究中提取鲍曼不动杆菌Ab-H株和Ab-B株荚膜多糖浓度分别为127.593μg/mL和30.047μg/mL,经鲎试剂法检测内毒素含量为0.01 EU/mL,经LC-MS分析两株鲍曼不动杆菌荚膜多糖成分相同。4.鲍曼不动杆菌Ab-H株和Ab-B株,以及纯化的荚膜多糖均可以诱导Raw 264.7细胞自噬和凋亡。鲍曼不动杆菌与Raw 264.7细胞共培养后,细胞LC3Ⅱ和Beclin-1蛋白表达量持续升高,且Ab-H组升高趋势高于Ab-B组（p<0.01）,Raw 264.7细胞凋亡趋势与细胞自噬相同;纯化荚膜也可以诱导Raw 264.7细胞自噬和凋亡,且诱导的自噬和凋亡强度与荚膜多糖浓度成正比。5.鲍曼不动杆菌和荚膜多糖均可以诱导Raw 264.7细胞表达活性氧,Ab-H组活性氧表达量高于Ab-B组（p<0.01）,荚膜多糖诱导Raw 264.7细胞表达活性氧能与浓度成正相关。6.鲍曼不动杆菌和荚膜多糖均可以抑制Raw 264.7细胞PI3K、Akt和mTOR蛋白磷酸化,Ab-B组Raw 264.7细胞磷酸化蛋白pPI3K、pAkt和pmTOR蛋白表达量高于Ab-H组（p<0.01）;荚膜多糖诱导Raw 264.7细胞磷酸化蛋白pPI3K、pAkt和pmTOR蛋白表达量与浓度成负相关。结论:鲍曼不动杆菌及其荚膜均能诱导Raw 264.7细胞自噬和凋亡,荚膜是诱导Raw 264.7细胞自噬和凋亡的重要毒力因子,其诱导能力与其浓度成正相关。鲍曼不动杆菌诱导Raw 264.7细胞自噬和凋亡可能是荚膜诱导Raw 264.7细胞产生大量活性氧并抑制PI3K-Akt-mTOR信号通路,最终引起Raw 264.7细胞自噬和凋亡。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 荚膜多糖
•     1.1.1 荚膜多糖的化学结构
•     1.1.2 荚膜多糖生成相关基因
•     1.1.3 荚膜多糖的免疫原性
•     1.1.4 荚膜多糖的致病性
•   1.2 外膜蛋白
•     1.2.1 外膜蛋白的化学结构
•     1.2.2 外膜蛋白的生物学功能
•     1.2.3 外膜蛋白的免疫原性
•   1.3 脂多糖
•     1.3.1 脂多糖的化学结构
•     1.3.2 脂多糖的生物学功能
•     1.3.3 脂多糖的致病性
•     1.3.4 脂多糖的免疫原性
•   1.4 外膜囊泡
•     1.4.1 外膜囊泡结构
•     1.4.2 外膜囊泡的生物学功能
•     1.4.3 外膜囊泡的致病性
•   1.5 磷脂酶
•   1.6 细菌侵入对宿主的影响
•     1.6.1 自噬
•     1.6.2 凋亡
•     1.6.3 活性氧（ROS）
•   1.7 研究目的
•   1.8 主要研究内容
•   1.9 研究方法
•   1.10 实验设计
•   1.11 研究意义
• 第二章 鲍曼不动杆菌鉴定及其荚膜多糖提取
•   2.1 实验材料和试剂
•   2.2 试剂配制
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 鲍曼不动杆菌的复苏
•     2.3.2 鲍曼不动杆菌DNA制备
•     2.3.3 鲍曼不动杆菌/不动杆菌鉴定
•     2.3.4 鲍曼不动杆菌荚膜刚果红染色
•     2.3.5 荚膜多糖提取
•     2.3.6 荚膜多糖含量检测
•     2.3.7 荚膜多糖内毒素含量检测
•     2.3.8 荚膜多糖组分的检测
•   2.4 结果
•     2.4.1 鲍曼不动杆菌鉴定结果
•     2.4.2 鲍曼不动杆菌荚膜多糖染色结果
•     2.4.3 粗提鲍曼不动杆菌荚膜多糖的多糖含量检测结果
•     2.4.4 粗提鲍曼不动杆菌荚膜多糖的内毒素含量检测结果
•     2.4.5 荚膜多糖组分的检测结果
•   2.5 讨论
• 第三章 鲍曼不动杆菌及其荚膜多糖诱导Raw264.7 细胞自噬和凋亡的研究
•   3.1 实验材料和试剂
•   3.2 试剂配制
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 细胞的复苏及传代
•     3.3.2 细胞总蛋白的提取
•     3.3.3 细胞总RNA的提取及cDNA的合成
•     3.3.4 实时荧光定量PCR
•     3.3.5 Western blotting
•     3.3.6 流式细胞术
•     3.3.7 实验结果判定
•     3.3.8 结果统计分析
•   3.4 实验结果
•     3.4.1 Raw264.7细胞正常及经过刺激之后的形态
•     3.4.2 经刺激后细胞内自噬相关基因Atg12表达量升高
•     3.4.3 经刺激后细胞内自噬相关蛋白表达量升高
•     3.4.4 经刺激后细胞内凋亡蛋白表达量升高
•     3.4.5 经刺激后细胞凋亡率增加
•   3.5 讨论
• 第四章 鲍曼不动杆菌及荚膜多糖诱导Raw264.7 细胞自噬和凋亡机制研究
•   4.1 实验材料和试剂
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 细胞总蛋白提取
•     4.2.2 Western blotting
•     4.2.3 流式细胞术
•     4.2.4 实时荧光定量PCR检测炎症小体相关基因表达量
•     4.2.5 实验结果判定
•     4.2.6 结果统计分析
•   4.3 实验结果
•     4.3.1 经刺激后细胞内PI3K-mTOR通路蛋白磷酸化降低
•     4.3.2 细胞内ROS含量的检测结果
•     4.3.3 经刺激后细胞内炎症小体相关基因表达量升高
•   4.4 讨论
• 第五章 结论与展望
•   5.1 结论
•   5.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 在校期间发表的学术论文及其他科研成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王廷廷

导师: 吴亮

关键词: 鲍曼不动杆菌,荚膜,鼠巨噬细胞,自噬,凋亡,信号通路

来源: 江苏大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 江苏大学

分类号: R392

总页数: 82

文件大小: 2583K

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