重组人PLCζ蛋白在昆虫细胞/杆状病毒表达系统内的表达、纯化及活性测定

论文摘要

PLCζ是PLC家族的一种新型同工酶,在哺乳动物卵母细胞激活中起着极其重要的作用。近年来,体外大量表达和纯化有活性的PLCζ蛋白用于结构生物学研究一直未能获得成功。本研究首次在杆状病毒表达系统中表达和纯化重组人PLCζ蛋白,首先将人PLCζ基因克隆至pFastBac-HTA质粒构建重组载体,转化DH10Bac发生位点特异性转座,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒Bacmid-PLCζ;在脂质体介导下将穿梭质粒转染Sf9昆虫细胞产生重组病毒,扩增病毒感染Sf9昆虫细胞进行蛋白表达;利用Ni2+亲和柱及分子筛来纯化蛋白,并通过考马斯亮蓝染色、Western blotting及飞行时间质谱对蛋白进行鉴定,并进行酶活性测定。结果显示重组蛋白在Sf9昆虫细胞感染杆状病毒后72 h达到峰值并以分泌形式表达在细胞培养基中,Ni2+亲和柱及分子筛纯化后的重组蛋白经Western blotting及电离飞行时间质谱鉴定为PLCζ蛋白,酶活性可达326.8 U/mL。该实验结果为重组人PLCζ蛋白大规模生产和生物医学应用研究提供了可参考利用的技术。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 主要实验材料
•   1.2 引物的设计与转移载体构建
•   1.3 重组杆状病毒穿梭载体的制备
•   1.4 重组杆状病毒的制备与鉴定
•   1.5 重组PLCζ蛋白的表达、纯化及鉴定
•   1.6 重组人PLCζ蛋白的活性检测
• 2 结果与分析
•   2.1 p Fast-Bac-HTA-PLCζ重组转移质粒的鉴定
•   2.2 Bacmid-PLCζ构建及鉴定
•   2.3 重组Bacmid-PLCζ转染Sf9细胞及病毒扩增
•   2.4 PLCζ重组蛋白的表达及鉴定
•   2.5 重组人PLCζ蛋白的活性测定
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 陈鑫,胡玥玥,徐鸿毅,王晓燕,邓锴

关键词: 蛋白,昆虫细胞,杆状病毒表达系统,表达,纯化,鉴定

来源: 生物工程学报 2019年06期

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 湖北医药学院附属人民医院生殖医学中心,湖北医药学院基础医学院

基金: 国家自然科学基金(No.81401200),湖北省自然科学基金(Nos.2018CFB219,2013CFB479),湖北省教育厅科学技术研究项目(Nos.B2015478,B2015493)资助~~

分类号: Q78

DOI: 10.13345/j.cjb.180507

页码: 1135-1142

总页数: 8

文件大小: 2147K

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