鸡舍内有害气体氨气对鸡脾脏免疫毒性的研究

论文摘要

氨气是一种具有刺激性气味的有害气体,通常可以在集约化养鸡场鸡舍内检测到较高浓度的氨气。尽管氨气的毒性是众所周知的,但氨气中毒（特别是脾脏等免疫器官）的机制研究很少。为了评价氨气对鸡的免疫毒性和研究氨气诱导的鸡脾脏炎症损伤以及细胞自噬的机制,本研究建立了鸡氨气中毒模型,采用qRT-PCR和western blot分别检测了三个水平（miRNA、mRNA和蛋白）上的变化。通过对鸡脾脏组织显微以及亚显微结构的观察和对氧化应激和能量代谢相关因子、Th1/Th2平衡相关细胞因子、炎症相关因子、自噬相关因子以及热休克蛋白水平的检测,探讨氨气引起的肉鸡氧化应激、能量代谢紊乱、炎症损伤、细胞自噬和热休克蛋白代偿性升高的机制。135只1日龄商品代罗斯308肉鸡随机分成对照组、中氨组和高氨组,每组45只鸡。每组肉鸡自由采食标准商品日粮和饮用水,其中对照组氨气浓度1-6周为≤5 mg/m3;中氨组氨气浓度1-3周为10±1 mg/m3,4-6周为15±1 mg/m3;高氨组氨气浓度1-3周为20±1 mg/m3,4-6周为45±1 mg/m3。在试验的第14天、28天和42天,分别从每组随机取15只鸡处死,采集脾脏组织样品。分别检测:脾脏组织的显微结构和亚显微结构,氧化应激相关指标（T-AOC、GSH-Px、CAT和SOD活性,GSH、MDA和H2O2含量）,能量代谢相关指标(Na+-K+ATPase、Ca2+ATPase、Mg2+ATPase和Ca2+-Mg2+ATPase活性),miRNA（miR-133a、miR-6615和miR-202-5p的水平）及其分别的靶基因（LOC101747543、SMAD7和PTEN的mRNA水平）,Th1/Th2平衡相关细胞因子（IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ的mRNA水平）,炎症相关因子（NO含量,iNOS活性,iNOS、HO-1、NLRP3炎症小体、NF-κB、TNF-α、COX-2和PTGEs的mRNA水平以及iNOS、HO-1和NF-κB的蛋白水平）、自噬相关因子（LC3-I、LC3-II、p62、PTEN、p53、PI3K、AKT、mTOR、Beclin1、Dynein、ATF3、ATG3、ATG5、ATG7、ATG10、ATG12、ATG14和ATG16L1的mRNA水平和LC3-I、LC3-II、PI3K、AKT和mTOR的蛋白水平）以及热休克蛋白（HSP27、HSP40、HSP60、HSP70和HSP90的mRNA水平和HSP60、HSP70和HSP90的蛋白水平）。试验结果显示:（1）氨气中毒引起鸡脾脏组织显微结构和亚显微结构改变,引起了鸡脾脏组织炎症损伤和细胞自噬。（2）氨气中毒引起鸡脾脏组织T-AOC、GSH-Px、CAT和SOD活性以及GSH含量降低,MDA和H2O2含量升高,导致鸡脾脏组织发生氧化应激。（3）氨气中毒引起肉鸡脾脏组织Na+-K+ATPase、Ca2+ATPase、Mg2+ATPase和Ca2+-Mg2+ATPase活性降低,导致鸡脾脏组织发生能量代谢紊乱。（4）氨气中毒升高了鸡脾脏组织miR-133a、miR-6615和miR-202-5p水平,下调了它们分别的靶基因LOC101747543、SMAD7和PTEN的mRNA水平。（5）氨气中毒降低了鸡脾脏组织IL-2和IFN-γ的mRNA水平,提升了IL-1β、IL-4和IL-6的mRNA水平,致使肉鸡脾脏组织的Th1/Th2平衡被打破并漂移向Th2。（6）氨气中毒降低了鸡脾脏组织抗炎因子HO-1的mRNA和蛋白水平;增加NO含量,iNOS活性,iNOS、NLRP3炎症小体、NF-κB、TNF-α、COX-2和PTGEs的mRNA水平以及iNOS和NF-κB的蛋白水平,导致了鸡脾脏组织的炎症损伤。（7）氨气中毒降低了鸡脾脏组织PI3K、AKT和mTOR的mRNA和蛋白水平,导致了鸡脾脏中PI3K/AKT/mTOR信号通路被抑制。（8）氨气中毒增加鸡脾脏组织LC3-I、LC3-II、p53、Beclin1、ATG14、ATG16L1、ATG12、ATG10、ATG5、ATG3、ATG7和Dynein的mRNA水平,降低ATF3和p62的mRNA水平导致了鸡脾脏组织的细胞自噬。（9）氨气中毒增加鸡脾脏组织HSP27、HSP40、HSP60、HSP70和HSP90的mRNA水平,以及HSP60、HSP70和HSP90的蛋白水平。机体动员了热休克蛋白来抵御氨气中毒。热休克蛋白的升高可能是一种代偿机制。结果表明,过量氨气对鸡脾脏具有免疫毒性,氨气中毒导致鸡脾脏氧化应激、能量代谢紊乱、Th1/Th2失衡、炎症损伤、细胞自噬和热休克蛋白增加。鸡脾脏在氨气中毒条件下,机体动员了热休克蛋白发生保护性反应,热休克蛋白的增加可能是一种抵抗氨气中毒的代偿机制。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 1 前言
•   1.1 有害气体氨气
•     1.1.1 家禽养殖业氨气排放现状
•     1.1.2 氨气的有害影响
•   1.2 相关miRNA的研究
•     1.2.1 miRNA及其作用机制
•     1.2.2 miRNA和炎症
•     1.2.3 miRNA和自噬
•   1.3 有害物质对脾脏造成的影响
•   1.4 氧化应激和能量代谢紊乱
•   1.5 有害物质造成的炎症
•   1.6 有害物质造成的Th1/Th2 失衡
•   1.7 有害物质造成的自噬
•   1.8 有害物质对热休克蛋白的影响
•   1.9 研究目的与意义
• 2 材料与方法
•   2.1 试验设备和药品
•     2.1.1 主要试验设备
•     2.1.2 主要试验药品
•   2.2 试验肉鸡和操作程序
•   2.3 脾脏的组织学观察
•     2.3.1 脾脏的显微结构观察
•     2.3.2 脾脏的亚显微结构观察
•   2.4 氧化应激和能量代谢指标的检测
•   2.5 实时荧光定量PCR实验
•     2.5.1 特异性引物
•     2.5.2 鸡脾脏中的总RNA提取和反转录
•     2.5.3 实时荧光定量PCR
•   2.6 蛋白印记实验
•   2.7 数据分析
• 3 结果与分析
•   3.1 鸡脾脏的组织学观察
•     3.1.1 鸡脾脏的显微结构观察
•     3.1.2 鸡脾脏的亚显微结构观察
•   3.2 鸡脾脏中氧化应激和能量代谢相关因子的测定
•     3.2.1 鸡脾脏中氧化应激相关因子的结果
•     3.2.2 鸡脾脏中能量代谢相关因子的结果
•     3.2.3 鸡脾脏中氧化应激与能量代谢相关因子的主成分分析
•   3.3 鸡脾脏miRNA及其靶基因的水平的测定
•     3.3.1 鸡脾脏炎症相关miRNA及其靶基因水平
•     3.3.2 鸡脾脏自噬相关miRNA及其靶基因水平
•   3.4 鸡脾脏中炎症相关因子的测定
•     3.4.1 鸡脾脏中NO含量、iNOS活力以及iNOS的 mRNA和蛋白水平
•     3.4.2 鸡脾脏中其他炎症相关因子的mRNA和蛋白水平
•   3.5 鸡脾脏中Th1/Th2 平衡相关细胞因子的mRNA水平
•   3.6 鸡脾脏中自噬相关因子的测定
•     3.6.1 自噬相关因子的mRNA水平热图
•     3.6.2 PI3K/AKT/mTOR信号通路相关因子的mRNA和蛋白水平
•     3.6.3 其他自噬相关因子的mRNA和蛋白水平
•   3.7 鸡脾脏中热休克蛋白的mRNA和蛋白水平测定
• 4 讨论
•   4.1 氨气中毒对鸡脾脏炎症相关因子的影响
•   4.2 氨气中毒对Th1/Th2 平衡相关细胞因子的影响
•   4.3 氨气中毒对HSPs的影响
•   4.4 氨气中毒对氧化应激和能量代谢的影响
•   4.5 氨气中毒对细胞自噬的影响
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 安阳

导师: 滕小华

关键词: 氨气,鸡脾脏,炎症损伤,细胞自噬,热休克蛋白

来源: 东北农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑,农业科技

专业: 生物学,环境科学与资源利用,畜牧与动物医学

单位: 东北农业大学

基金: 国家重点研发计划(No. 2016YFD0500501),动物营养国家重点实验室开放项目(2004DA125184F1714),中国农业研究系统(No. CARS-42)

分类号: X171.5;S858.31

总页数: 64

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