利用荧光辅助的超分辨率流式技术对RIP3多聚体的纯化

论文摘要

蛋白质复合物的分离与纯化是了解蛋白质复合物内部蛋白组成、空间结构、功能性质等重要且普遍的实验方法。对于特殊的蛋白质复合物的纯化仍需不断地优化已有的实验方法、发展更适合的纯化途经。以细胞坏死关键蛋白RIP3为例,RIP3能够多聚化形成分子量超过5MDa的蛋白多聚体,在普通的免疫共沉淀蛋白质复合物的实验方法中,较高的离心速度会导致绝大部分分子量较大的RIP3多聚体进入到沉淀之中,导致该组分所包含的信息丢失。因此,如何对分子量较大的RIP3进行分析和纯化成为相关研究者亟待解决的问题之一。本研究首次利用超分辨率分选型流式细胞仪MoFloAstrios EQ（Beckman Coulter）实现了对荧光标记的RIP3多聚体的分析与纯化。首先我们对野生型RIP3及其突变体进行了mScarlet红色荧光标记,并通过293T过表达系统使其多聚化。在细胞裂解后,经过差速离心法取得RIP3多聚物的粗纯化组分。我们以100/200/300nm的标准乳胶微球为参考,对RIP3及其突变体RHIM的粗纯化组分中的mScarlet阳性颗粒进行分选,经超速离心浓缩后我们利用银染法对蛋白量进行了测定。我们还通过Western Blot、DDA-MS质谱技术与银染法对分选前后的蛋白质组成及纯化效果进行了分析,说明了流式分选技术可以通过去除背景蛋白,实现目的蛋白复合物纯度由20%至80%的提高,肽段丰度2～3倍的提升。尽管在实际操作中也尚有许多细节问题需要考量及优化,我们认为荧光辅助的流式分选技术在蛋白质复合物的纯化的应用具备一定的可行性,我们的初步探究结果也为蛋白质复合物的研究提供了崭新的视角和思路。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
•   1.1 蛋白质复合物
•     1.1.1 蛋白质复合物概述
•     1.1.2 实验室常见的蛋白质复合物纯化方法
•   1.2 受体相互作用蛋白RIP3
•     1.2.1 细胞坏死与由TNF受体介导的信号通路概述
•     1.2.2 RIP3概述
•     1.2.3 RIP3与淀粉样蛋白复合物
•   1.3 流式细胞术
•     1.3.1 流式细胞术概述
•     1.3.2 亚细胞结构的分选与纯化
•   1.4 立题背景
• 第二章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 细胞实验相关材料
•     2.1.2 基因信息及分子克隆相关试剂
•     2.1.3 蛋白质实验相关试剂
•   2.2 实验仪器
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 分子克隆相关实验方法
•     2.3.2 细胞实验相关实验方法
•     2.3.3 流式细胞技术相关实验方法
•     2.3.4 蛋白质实验相关实验方法
•     2.3.5 共聚焦实验相关实验方法
• 第三章 实验结果与分析
•   3.1 实验可行性分析
•     3.1.1 RIP3可形成平均长度大于100nm的淀粉样多聚体
•     3.1.2 MoFloAstrios EQ流式细胞仪能够区分100/200/300nm的标准微球
•     3.1.3 mScarlet-RIP3能介导TSZ诱导下HeLa细胞的细胞坏死
•   3.2 RIP3多聚物的获取
•     3.2.1 在293T中过表达mScarlet-RIP3及其突变体会导致RIP3多聚化
•     3.2.2 P11K组分的取得和初步分析
•   3.3 利用MoFloAstrios EQ对RIP3聚合物的分析与分选
•   3.4 对纯化效果的综合评估
•   3.5 小结与讨论
• 附录1 图表索引
• 附录2 缩略语及中英文对照
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王卓

导师: 韩家淮

关键词: 蛋白质复合物,纯化,受体相互作用蛋白

来源: 厦门大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 厦门大学

分类号: Q503

总页数: 70

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