导读:本文包含了克隆化论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:细胞,受体,基因,蛋白,干细胞,疫苗,载体。
克隆化论文文献综述
王春燕[1]（2016）在《猪瘟C株疫苗免疫前后CD4~+T细胞αβTCR的多样性及寡克隆化研究》一文中研究指出T细胞受体(T cell receptor,TCR)是表达于T细胞表面的异二聚体复合物,是T细胞的重要表面标志,其中αβTCR识别由主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)分子递呈的抗原肽。TCRα链和β链均有三个互补决定区(complementary determining regions,CDRs)–CDR1、CDR2和CDR3,其中CDR3区与抗原肽识别和结合有关,不同的CDR3序列代表不同的T细胞克隆,即一种CDR3序列就是一种T细胞克隆,因此通过监测CDR3的谱型变化可以反映T细胞的克隆性。目前,由于基因扫描-谱型分析技术具有快速、敏感和高效的特点,已作为肿瘤、病毒感染、自身免疫病及移植排斥反应中检测T细胞TCR CDR3谱型变化的常规技术,现已成功揭示了机体免疫稳定状态下及临床疾病状态下αβTCR的变化规律,并将抗原特异的TCR基因用于免疫治疗中,已取得了一定的成果。迄今为止,国内外对猪T细胞TCR在病原感染和疫苗免疫状态下的研究很少,但猪的免疫学尤其是T细胞免疫机制的研究不仅有助于猪病防控,也有助于人类异体器官移植。因此,本研究主要利用基因谱型分析技术研究临床健康猪T细胞αβTCR基因的多样性及猪瘟C株疫苗免疫后CD4~+T细胞αβTCR的寡克隆性,为深入研究猪瘟病毒感染的细胞免疫机制以及猪瘟新型疫苗的研制提供技术和理论基础。本研究取得的主要进展如下:1.成功分析了临床健康猪CD4~+和CD8~+T细胞TCRα链和β链基因家族CDR3区谱型及长度多样性。采用RT-PCR基因扫描分析技术从健康猪CD4~+和CD8~+T细胞中克隆了猪的19个TCR AV和20个TCR BV基因家族。谱型分析结果表明,19个TCR AV和20个TCR BV基因家族在两类细胞亚群中均有表达,且每个家族的谱型均呈典型的高斯分布,多数家族含有八种以上不同长度的CDR3序列,相邻CDR3序列间一般相差3 bp,表明健康状态下T细胞受体CDR3区具有长度和序列多样性。此外,同一TCR家族在两种T细胞亚群的表达频率不同,即使是同一细胞亚群,不同家族的表达水平也有差异。这种临床健康猪CD4~+和CD8~+T淋巴细胞αβTCR的多样性有利于机体识别各种抗原肽,以维持免疫内环境的稳定。2.成功分析了猪瘟C株疫苗免疫后猪CD4~+T细胞αβTCR的变化规律。以猪瘟C株疫苗免疫4头同窝合作小型猪,利用基因扫描–谱型分析技术分析免疫前后CD4~+T细胞TCR各家族CDR3区谱型变化。结果显示,大多数谱型变化的家族在免疫后第3天即抗体产生之前就出现克隆性扩增的变化,且这种克隆化趋势达到高峰后逐渐减退,直至免疫后第15天TCR的谱型又恢复到了免疫前的高斯分布。#884猪TCR AV14、AV38和TCR BV6S,#888猪TCR AV8-3S和TCR BV30,#892猪TCR AV5S、AV8-3S、AV8-4S、AV14和TCR BV4S、BV7S、BV15家族呈现单寡克隆化增殖趋势。其中,TCR AV14在#884和#892猪,TCR AV8-3S在#888和#892猪均呈克隆化表达,且TCR AV5S、AV38和TCR BV6S在猪瘟病毒C株感染的外周血单个核细胞中也有发现,表明PBMCs和CD4~+T细胞可能对猪瘟病毒同一抗原肽产生了免疫应答。3.成功分析了猪瘟C株疫苗免疫的呈克隆性扩增的CD4~+T细胞TCR AV和BV家族CDR3的保守氨基酸基序。RT-PCR扩增上述TCR基因家族的CDR3区并进行克隆测序和生物信息学分析,发现尽管同一基因家族CDR3序列不完全相同,但其都含有保守的氨基酸序列。所有呈克隆性扩增的TCR AV家族CDR3区均含有“LX”基序,BV家族具有保守的“GGA”基序。这些保守的CDR3氨基酸基序可能与猪瘟病毒抗原肽识别和结合有关,这为猪瘟多肽疫苗的高通量筛选和开发奠定了基础。4.成功扩增了猪瘟病毒C株特异的TCR AV5S和TCR BV6S全长基因序列,在序列分析的基础上构建了两个真核表达质粒并进行共转染表达研究。基因序列分析表明,克隆的TCR AV5S全长816 bp,编码272个氨基酸;克隆的TCR BV6S全长945 bp,编码315个氨基酸。体外单独转染和共同转染表明两种质粒可以实现体外共表达,这为猪瘟病毒抗原特异TCR基因的免疫学功能验证模型建立了实验方法。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2016-05-01）
宋秀燕[2]（2015）在《慢性乙型肝炎患者CD_8~+ T细胞TCR-Vβ基因CDR3区克隆化特征的研究》一文中研究指出目的:检测慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血T细胞TCR-Vβ基因CDR3的克隆化特征。方法:选择20例慢性乙型肝炎患者设为观察组;选择20例健康体检者设为对照组,采用多引物巢式PCR法两步扩增22个TCR-Vβ基因亚家族,高分辨率琼脂糖凝胶电泳法定性检测两组研究对象的PCR产物的克隆化特征。结果:CHB患者CD_8~+T细胞TCR-Vβ1、Vβ3、Vβ9、Vβ14出现优势增生。结论:CHB患者外周血CD_8~+T细胞Vβ1、Vβ3、Vβ9、Vβ14存在克隆性增生。(本文来源于《中国民康医学》期刊2015年24期）
张吉林,常哲兴,宋宇,熊英,宋玉国[3]（2015）在《肿瘤患者外周血CD4~+和CD8~+ T淋巴细胞TCR Vβ基因克隆化分析》一文中研究指出目的探讨肿瘤患者T细胞抗原受体(TCR)Vβ基因克隆化改变特征.方法应用多引物巢式PCR技术检测肿瘤患者外周血CD4+T细胞和CD8+T细胞TCR Vβ基因22个亚家族的克隆化改变,与正常对照组比较,分析肿瘤患者TCR单克隆改变的特点.结果 CD8+T细胞TCRVβ基因亚家族单克隆改变的数量多于CD4+T细胞;肿瘤患者的CD4+T细胞中,只有Vβ2,Vβ7和Vβ8叁个亚家族单克隆改变高于正常对照组(P<0.01或P<0.05),其他Vβ亚家族单克隆改变与正常对照组无明显差异.肿瘤患者的CD8+T细胞中,有14个Vβ亚家族单克隆改变均高于正常对照组(P<0.01或P<0.05);4组肿瘤患者中,CD4+T细胞和CD8+T细胞的TCR Vβ7亚家族的单克隆改变均明显高于正常对照组(P<0.01或P<0.05).结论通过检测TCR Vβ基因克隆化改变,可以初步了解T细胞对肿瘤的免疫应答状况.(本文来源于《北华大学学报(自然科学版)》期刊2015年05期）
梁博文[4]（2015）在《电视娱乐节目克隆化现象研究》一文中研究指出当前,我国电视娱乐节目仍在发展中,其质量无法与需求量成正比,这就衍生了一种我国娱乐类电视节目独有的现象——快速的克隆与模仿。本文将结合实例对此进行探讨与分析,研究其原因、问题,为我国未来电视类娱乐节目的发展提供一些启示。(本文来源于《西部广播电视》期刊2015年15期）
王建军,万志红,赵平,靳雪源,谢国明[5]（2015）在《Tat融合蛋白表达载体TAT-c-Myc的克隆化及蛋白表达研究》一文中研究指出目的构建重组表达载体TAT-c-Myc,在E.coli BL21中高效表达并纯化融合蛋白。方法经PCR获得编码人c-Myc的全基因序列,含有设计的限制性酶切位点的产物连接到含有TAT转导结构的原核表达载体PET-28b-TAT-V2上,得到重组表达载体TAT-c-Myc,转化大肠杆菌,应用IPTG诱导TAT-c-Myc融合蛋白的表达。表达产物用SDS-PAGE鉴定,亲和层析柱纯化,并应用Western blot检测蛋白的特异性,融合蛋白转导人皮肤成纤维(HSF)细胞的效果应用免疫荧光检测。结果成功构建了TAT-c-Myc融合蛋白的原核表达载体,在诱导下获得了高效表达。Western blot检测提示融合蛋白有良好的特异性。免疫荧光检测提示融合蛋白具有快速转导入HSF细胞内的能力。结论为进一步的通过蛋白转导方式诱导多能干细胞提供了物质基础。(本文来源于《中华临床医师杂志(电子版)》期刊2015年05期）
李奕芙,赵昌亮,朱瑞良,黄璇,潘德芹[6]（2015）在《泰山松花粉多糖对超强毒IBDV克隆化毒株的免疫增强效果》一文中研究指出筛选了4株氨基酸序列差异显着的超强毒力传染性法氏囊病毒(vvIBDV)的细胞弱化毒株GXCL1-25、GXCL2-30、GXCL4-25、GXCL5-30制备活疫苗(加入泰山松花粉多糖为免疫佐剂,蜂胶佐剂作为对照),并分别对这些疫苗的免疫效果进行分析。分别测定4株病毒克隆株的TCID50,并分别制备相应的佐剂活疫苗进行接种试验。对4株病毒克隆分别设置无免疫佐剂疫苗接种组(A1、B1、C1、D1)、松花粉多糖佐剂疫苗接种组(A2、B2、C2、D2)、蜂胶佐剂疫苗接种组(A3、B3、C3、D3)及空白对照组(E)。每组接种SPF鸡50只,于14日龄首免,25日龄二免。分别于一免后0、3、7d和二免后3、10、17、24d采血,用ELISA方法检测血清抗体效价和IL-2分泌水平;28日龄与42日龄测定外周血淋巴细胞比率,28日龄每组剖杀5只测免疫器官指数;35日龄进行攻毒试验。结果显示,各试验组的抗体效价和IL-2水平均在35日龄时(二免后第10天)达到最高峰,但佐剂疫苗组与无佐剂疫苗组相比具有更高的IBDV抗体水平、更长的抗体维持时间长、更轻的法氏囊损伤,并且攻毒保护率均在90%以上;尤其松花粉多糖佐剂疫苗组的抗体效价、IL-2水平和淋巴细胞比率比其他组更高,且松花粉多糖为佐剂的GXCL4-25组免疫效果最好。结果表明,以泰山松花粉多糖为佐剂的IBDV细胞弱化活疫苗表现出良好的免疫原性和保护力。(本文来源于《中国兽医学报》期刊2015年01期）
王建军,万志红,赵平,靳雪源,谢国明[7]（2013）在《Tat融合蛋白表达载体TAT-OCT4的克隆化及蛋白表达研究》一文中研究指出目的构建重组表达载体TAT-OCT4,在E.coli BL21中高效表达并纯化融合蛋白。为进一步通过蛋白转导方式诱导多能干细胞提供物质基础。方法经RT-PCR获得编码人OCT4的全基因序列,连接到原核表达载体TAT-V2上,得到重组表达载体TAT-OCT4,转化大肠埃希菌,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导TAT-OCT4融合蛋白的表达。表达产物用SDS-PAGE鉴定,亲和层析柱纯化融合蛋白,并应用Western Blot检测蛋白的特异性,应用免疫荧光检测融合蛋白转导人皮肤成纤维(human skin fibroblasts,HSF)细胞的效果。结果成功构建了TAT-OCT4融合蛋白的原核表达载体,在诱导下获得了高效表达并纯化了融合蛋白,Western Blot鉴定正确。免疫荧光提示融合蛋白可快速转导入HSF细胞内。结论 TAT-OCT4融合蛋白可以安全,高效地转导入HSF细胞中。(本文来源于《解放军医学院学报》期刊2013年08期）
高帆,邵杰,王一平,李玫颖,毛群颖[8]（2012）在《EV71疫苗诱导小鼠CD4~+ T细胞受体Vβ17基因家族克隆化改变》一文中研究指出目的分析EV71疫苗诱导BALB/c小鼠CD4+TCR Vβ基因家族克隆化改变,探讨EV71疫苗免疫机制。方法采用TCR克隆化检测试剂盒和基因扫描技术对EV71疫苗诱导的BALB/c小鼠CD4+TCRVβ基因家族克隆化进行分析,并结合ELISPOT方法、Luminex技术和体外微量中和试验研究EV71疫苗诱导的细胞免疫和体液免疫应答情况,探讨EV71疫苗免疫机制。结果通过对小鼠CD4+TCR Vβ1-20克隆化检测,发现免疫组的Vβ17基因家族出现单克隆或寡克隆改变,对照组Vβ17为多克隆化,未见克隆化改变。免疫组小鼠脾MNC(去除CD8+)IFN-γ和IL-6的分泌水平较对照组显着增高(P均<0.01),血清EV71中和抗体应答均为阳性。进一步测序发现,免疫组Vβ17的CDR3区氨基酸序列为TASQNTLY。结论成功筛选出EV71疫苗诱导BALB/c小鼠CD4+TCR特异性改变的Vβ基因家族为Vβ17,与MHC-EV71抗原肽特异性结合的CDR3区氨基酸序列为TASQNTLY。(本文来源于《中国病毒病杂志》期刊2012年05期）
赵昌亮[9]（2012）在《IBDV致病性与VP5基因关系及GX8/99株细胞克隆化毒株免疫原性的研究》一文中研究指出传染性法氏囊病(Infectious bursal disease, IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)引起鸡的急性、高度接触性传染病，主要侵害鸡的中枢免疫器官—法氏囊，是危害世界养禽业的主要传染病之一。该病毒导致免疫抑制，造成对其他疫病的易感性增强和降低对其它疫苗的反应性。近年来，IBDV在分子水平对IBDV的免疫机理、致病机制、病毒分子的结构与功能方面取得很大的进展，但是仍有许多地方有待于进一步研究，特别是变异株、vvIBDV的出现，抗原的变异和多样性、血清亚型，使本病的防治和临床诊断困难，对养鸡业造成严重损失。IBDV为双RNA病毒科禽双RNA病毒属，利用当地分离的变异株或选用抗原性与当地变异株接近的疫苗株制成灭活苗或弱毒苗，以及利用多种毒株联合制成多价疫苗，可以使鸡群得到很好的免疫保护。我们在实施国家自然基金重大项目过程中，感染vvIBDV GX8/99株的鸡的发病率和死亡率比较高，鸡场出现免疫失败的现象频繁发生。本课题拟以vvIBDV GX8/99株为研究对象，将vvIBDVGX8/99株进行传代，研究从原始毒（鸡源毒）→鸡胚毒→细胞适应毒→细胞克隆化毒→克隆化毒株的细胞传代至30代的致病性，免疫原性的变化规律及其与核苷酸、氨基酸之间的关系。更好地掌握vvIBDV在整个传代致弱的过程中的免疫原性变化特点、 vvIBDV“个体效应”的变化规律，同时进行不同免疫佐剂对四株克隆化毒株免疫效果影响的试验以探寻更好的佐剂和疫苗组合，为我国vvIBDV分子流行病学的研究及IBD的有效防治奠定基础。揭示超强毒的演变规律和毒力改变的分子基础，为解决超强毒毒力增强、超强毒能否致弱以及致弱过程中基因序列和核苷酸序列的变化，这种变化与病毒生物学特性的关系，弱毒株的生物学特性如何等急需解决的问题提供依据。1.超强毒IBDV GX8/99株不同传代毒致病性与VP5基因的关系分析本研究将vvIBDV GX-8/99株原代毒、鸡胚毒、克隆化毒、回传SPF鸡10代次毒及克隆化细胞传代20代次毒分别测定ELD_(50)，以相同的ELD_(50)病毒量分别接种SPF鸡，从而观察vvIBDV GX-8/99株在传代过程中致病性的变化规律。同时分别提取病毒RNA，通过RT-PCR、PCR扩增、基因克隆、核苷酸序列测定和分析，对IBDVGX8/99株的24株不同传代毒的VP5基因进行比较，发现其同源性在94%-100%之间。并且有15个易发生变异的位点，其中位点bp#2、#8、#52、#145、#232、#272、#310、#364、#385、#409的碱基变异引起了相应氨基酸的改变，而位点bp#18、#285、#331、#354、#397的碱基变异没有引起相应氨基酸的变化。通过比较分析，可以看到在致死率由原代毒的86.7%降为GXE10的43%时，VP5基因的核苷酸有四个位点发生了变异，致死率由GXE10的43%降为GXC23的3.3%时，VP5基因的核苷酸有10个位点发生了变异；而将GXC23克隆化后的4株毒株致病性变化不大，并且仅在GXCl1-1的#8位点，GXCl2-1和GXCl4-1的#364位点发生变异；将4株克隆化毒株回传SPF鸡10代后的致死率有一定程度的回升，且有两个位点发生变异；4株克隆化毒株在细胞上连续传20代后其致死率都降为0，并且克隆株5没有发生核苷酸变异，而克隆株1、2、4也仅有一个核苷酸位点发生变异。由此推论vvIBDV的致病性与VP5某些氨基酸的变异有一定的关系，更可能与病毒对细胞的亲嗜性关系密切，这为探明超强毒法氏囊病毒毒力改变的分子基础，从而解释自然界中vvIBDV出现的原因和致弱的原因提供了佐证。2. vvIBDV GX8/99克隆化毒株细胞致弱毒VP5基因原核表达系统的建立本研究以vvIBDV GX8/99株4株克隆化细胞毒GXCL1、GXCL2、GXCL4、GXCL5为研究对象，将4株已在CEF上连续传20代的克隆化细胞毒通过鸡胚成纤维细胞再传10代，对各克隆化毒每隔四代毒株的VP5基因进行测序。根据两部分的测序结果，从中选取3株氨基酸序列差异较大的毒株（GXCl1-1、GXCl2-10、GXCl4-25）的VP5基因作为本部分的研究内容。应用RT-PCR技术从上述3毒株中扩增得到VP5基因，并将其克隆到原核表达载体pET32a中，构建了重组原核表达质粒pET32a-VP5，对重组表达质粒鉴定正确后，转化大肠埃希菌Rosetta进行诱导表达，SDS-PAGE和Western blot检测结果表明，IBDV-VP5基因在大肠埃希菌Rosetta中得到了正确表达，所表达的融合蛋白与IBDV阳性血清具有特异性抗原抗体反应。3.泰山松花粉多糖对4株IBDV克隆化毒株免疫增强效果的影响根据第二部分的研究选取4株氨基酸序列差异显着的克隆化毒株GXCL1-25、GXCL2-30、GXCL4-25、 GXCL5-30，并采用泰山松花粉多糖为免疫佐剂（蜂胶佐剂作为对照），对其免疫效果进行分析。将4株细胞毒测TCID_(50)统一定量后，每一毒株分别设置无免疫佐剂（1、4、7、10），松花粉多糖佐剂（2、5、8、11），蜂胶佐剂（3、6、9、12）叁个平行试验组，并设一组生理盐水空白对照组（13）。免疫SPF鸡，14日龄首免，25日龄进行二免。分别于一免疫后0、3、7d，二免后3、10、17、24d采血，用ELISA方法检测血清抗体效价和IL-2水平，全自动血细胞分析仪测定28与42日龄的外周血淋巴细胞比率，于28、42日龄每组剖杀5只测免疫器官指数，35日龄进行攻毒试验。对各试验组试验结果进行分析可发现二免后第10d左右抗体和IL-2水平均达到高峰，4株克隆化细胞毒免疫鸡造成了一定的法氏囊的损伤，而含免疫佐剂组避免了损伤的发生。攻毒试验表明各毒株免疫效果明显，但相互之间也存在一定的差异性。通过不同毒株与佐剂的免疫组合，全面分析其免疫效果，综合比较可得出以松花粉多糖为佐剂的GXCL4-25组免疫效果最好，为控制vvIBDV的感染提供一条新的途径。(本文来源于《山东农业大学》期刊2012-06-15）
牛莹[10]（2012）在《非转染人角膜基质细胞系的建立、鉴定及其克隆化研究》一文中研究指出角膜（cornea）是位于眼球最前部的一层透明膜，能为眼睛提供大部分的屈光力，加上晶体的屈光力，便可使光线准确聚焦在视网膜上成像。人角膜基质（HumanCorneal Stroma, HCS）是角膜构成的主要部分，占角膜厚度的90%，在维持角膜透明及允许光线穿过中具有至关重要的作用。很多原因均可引起HCS发生异常性病变，且HCS病变具有患病率高、致盲性强和临床治疗困难等特点。目前唯一的治疗办法是进行角膜移植术，但由于捐献角膜的高度匮乏，致使绝大多数叫膜基质异常患者因无法得到供体角膜而不能复明。近年来，角膜组织工程的兴起使体外重建组织工程人角膜基质（Tissue-Engineered Human Corneal Stroma, TE-HCS）成为可能，也给众角膜基质异常患者带来了重见光明的希望。在TE-HCS的体外重建中，大量正常HCS种子细胞的来源和理想载体支架的获得是急需解决的两个关键问题，尤其是HCS种子细胞的来源问题更是制约TE-HCS规模化体外重建的瓶颈。虽然已有利用癌基因转染建立人角膜基质人角膜基质细胞（Human Corneal Stromal Cell, HCSC）细胞系的报道，但因这类细胞具有潜在致瘤性而无法应用于临床，而建立非转染、无致瘤性的HCSC细胞系被认为是解决大量正常HCS种子细胞来源问题的希望。但目前为止，仍未见成功建立非转染、无致瘤性的HCSC细胞系有关报道。为了解决HCSC种子细胞来源问题，本文利用胰酶消化联合组织块贴壁法启动了HCSC的原代培养，通过添加促贴壁、生长和分裂的物质获得可继代培养的HCSC，建立非转染HCSC细胞系，并对其细胞属性、功能蛋白表达和致瘤性进行鉴定，进而利用克隆化培养方法从此细胞系中筛选出单克隆细胞株，经扩增培养后再次进行细胞属性等鉴定，为利用细胞属性正常的单克隆细胞株开展HCSC相关理论研究和TE-HCS的体外重建研究奠定基础。为了建立非转染HCSC细胞系，本文将撕除角膜内皮层和上皮层得到的HCS片进行了胰蛋白酶适度消化，然后将组织块平贴于用明胶包被的24孔板中，加入含5%胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）的DMEM/F-12培养液置37℃、5%CO2培养箱中启动原代培养。24h后将培养液更换为HCSC专用培养液，即含有碱性成纤维细胞生长因子（Basic Fibroblast Growth Factor，bFGF）、表皮生长因子（EpidermalGrowth Factor，EGF）、硫酸软骨素（Chondroitin Sulfate，CS）、羧甲基壳多糖（Carboxymethyl Chitosan，CM-CH）和20%FBS的DMEM/F-12完全培养液。跟踪观察发现，启动培养2d后组织块周围开始有纤维样细胞迁出，14d便可长成完整的细胞单层，进而利用HCSC专用培养液成功进行了继代培养。观察结果显示，HCSC贴壁能力强，在体外呈现稳定的成纤维样细胞形态，且生长分裂旺盛并能稳定持续传代，细胞经冻存复苏后依然保持良好的生长状态和增殖能力，现已传至第40代。为了鉴定所建立的非转染HCSC细胞系的属性和潜能，本文对第40代HCSC细胞的形态、生长特性、核型以及功能蛋白的表达等进行了鉴定。细胞属性检测结果显示，第40代HCSC依然呈典型的成纤维样细胞形态，能活跃生长和分裂，其群体倍增时间为41.44h，该细胞系细胞虽然出现了染色体的非整倍性，但其特征性染色体数目依然46条，并具有典型的人类染色体特征；对HCSC细胞系的免疫荧光检测结果显示，该细胞系细胞仍具有HCSC特异性标志蛋白——波形蛋白的阳性表达，综合核型特征可知，本文所建立的非转染细胞系确为HCSC细胞系。为了鉴定所建立细胞系的潜能，本文又对该细胞系细胞进行了功能蛋白——细胞连接蛋白和膜运输蛋白表达的免疫荧光检测，发现该细胞系仍具有细胞连接蛋白——间隙连接蛋白CX-43和整联蛋白β1的阳性表达，也保持有膜运输蛋白——钠钾泵和钙泵的阳性表达，表明该细胞系细胞仍具有形成细胞间以及细胞与细胞外基质间细胞连接的潜能，还保持有对Na+、K+和Ca2+主动运输的潜能。可见，本文所建立的非转染细胞系不仅具有HCSC的属性，而且还保持有细胞连接蛋白和膜运输蛋白的阳性表达，具有行使正常HCSC功能的潜力。为了获得可用于TE-HCS体外重建的核型正常的HCSC种子细胞，本文又利用克隆化培养技术对已建立非转染HCSC细胞系进行了克隆化研究。利用有限稀释法对HCSC细胞系进行了克隆化实验，共获得了15个单克隆细胞株，核型鉴定结果显示，有3个单克隆细胞株的染色体数目为46条且具有正常二倍体核型。取其中一个单克隆细胞株C5G再次进行生长特性的鉴定和标志蛋白表达的检测。鉴定与检测结果显示，该单克隆细胞株细胞群体倍增时间为40.39h，仍保持有旺盛的生长分裂活性，并具有波形蛋白的阳性表达，说明该细胞株确为HCSC单克隆细胞株，可被用作种子细胞进行TE-HCS及全层角膜的体外重建研究。综上所述，本文成功建立了细胞属性和功能蛋白表达正常的非转染HCSC细胞系，并从中筛选出了细胞属性正常的单克隆细胞株，初步解决了足量HCSC种子细胞的来源问题，为TE-HCS及全层角膜的规模化体外重建及其临床应用创造了条件。(本文来源于《中国海洋大学》期刊2012-06-01）
克隆化论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的:检测慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血T细胞TCR-Vβ基因CDR3的克隆化特征。方法:选择20例慢性乙型肝炎患者设为观察组;选择20例健康体检者设为对照组,采用多引物巢式PCR法两步扩增22个TCR-Vβ基因亚家族,高分辨率琼脂糖凝胶电泳法定性检测两组研究对象的PCR产物的克隆化特征。结果:CHB患者CD_8~+T细胞TCR-Vβ1、Vβ3、Vβ9、Vβ14出现优势增生。结论:CHB患者外周血CD_8~+T细胞Vβ1、Vβ3、Vβ9、Vβ14存在克隆性增生。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
克隆化论文参考文献
[1].王春燕.猪瘟C株疫苗免疫前后CD4~+T细胞αβTCR的多样性及寡克隆化研究[D].中国农业科学院.2016
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[3].张吉林,常哲兴,宋宇,熊英,宋玉国.肿瘤患者外周血CD4~+和CD8~+T淋巴细胞TCRVβ基因克隆化分析[J].北华大学学报(自然科学版).2015
[4].梁博文.电视娱乐节目克隆化现象研究[J].西部广播电视.2015
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[8].高帆,邵杰,王一平,李玫颖,毛群颖.EV71疫苗诱导小鼠CD4~+T细胞受体Vβ17基因家族克隆化改变[J].中国病毒病杂志.2012
[9].赵昌亮.IBDV致病性与VP5基因关系及GX8/99株细胞克隆化毒株免疫原性的研究[D].山东农业大学.2012
[10].牛莹.非转染人角膜基质细胞系的建立、鉴定及其克隆化研究[D].中国海洋大学.2012
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