导读:本文包含了间隙连接通讯论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:间隙,细胞,通讯,雌激素,肝癌,染料,芫花。
间隙连接通讯论文文献综述
张辉[1]（2018）在《雌激素膜受体GPR30在山羊卵丘卵母细胞复合体间隙连接通讯中的作用及其机制研究》一文中研究指出哺乳动物卵泡主要由卵泡体细胞和生殖细胞组成,颗粒细胞间、卵丘细胞间及卵丘细胞与卵母细胞间存在着间隙连接(gap junction),从而形成了一个功能性合胞体。卵泡发育过程中,卵母细胞周围出现透明带,卵丘细胞与卵母细胞膜间形成跨带突触(transzonal cytoplasmic projections,TZPs),形似丝状伪足,其末端也形成间隙连接;间隙连接为卵母细胞发育输送大量信号物质和能量,也在卵母细胞成熟调控和排卵过程中发挥重要作用。在卵母细胞自发成熟或促性腺激素诱导的卵母细胞成熟过程中,都伴随着卵泡颗粒细胞间隙连接的减少,卵丘细胞与卵母细胞间的间隙连接则逐渐关闭甚至消失。研究发现,促黄体素(luteinizing hormone,LH)可作用于颗粒细胞的隙连接,终止cGMP等减数分裂抑制物质的传输,诱导卵母细胞恢复减数分裂。雌激素在卵泡发育过程中也能调节间隙连接相关蛋白的表达,但雌激素调控卵丘卵母细胞复合体(Cumulus oocyte complex,COCs)间隙连接通讯功能和相关机制尚不明确。本研究通过检测山羊COCs体外成熟培养过程中卵母细胞生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)的发生,研究17β-雌二醇(17β-E_2)对GVBD发生的调节及其作用通路,以及TZPs数量和间隙连接通讯动态变化在卵母细胞核成熟过程中的作用,探讨雌激素对山羊COCs间隙连接通讯和卵母细胞核成熟进程的影响,揭示间隙连接在卵母细胞成熟过程中的功能状态及其调控机制。研究内容和结果如下:(1)采用Hoechst33342对山羊卵母细胞核染色后,进行染色质形态观察,检测17β-E_2在山羊COCs体外培养过程中的作用。山羊COCs在基础培养液或添加1μg/mL17β-E_2处理,体外培养2,4,6 h和8 h,结果表明在17β-E_2处理到4 h和6 h时,卵母细胞GVBD发生率显着高于不添加17β-E_2的对照组;进一步采用雌激素核受体(estrogen recepter,ER)抑制剂ICI182780,雌激素膜受体(G protein coupled receptor30,GPR30)抑制剂G15或激动剂G1,研究雌激素促进山羊卵母细胞核成熟进程的受体通路,结果表明,17β-E_2促进山羊卵母细胞GVBD的发生的作用能被雌激素膜受体GPR30激动剂G1模仿,而能被GPR30抑制剂G15所抑制;核受体抑制剂ICI182780却不能抑制17β-E_2对山羊卵母细胞GVBD发生的促进作用。说明,在山羊COCs体外培养过程中,1μg/mL 17β-E_2能够促进卵母细胞提前发生GVBD,这种促进作用是由其膜受体GPR30介导的。(2)卵母细胞核成熟进程中,TZPs数量和间隙连接通讯功能均会发生动态变化,但这些动态变化是否受雌激素及其受体通路调控,需要进一步验证。利用免疫荧光技术,检测新鲜分离、成熟培养前山羊COCs中GPR30和间隙连接蛋白CX43的表达与定位,结果表明成熟培养前山羊COCs的卵丘细胞和卵母细胞均存在GPR30和CX43表达,并定位于细胞膜上。为了验证TZPs在17β-E_2促进山羊卵母细胞提前发生GVBD中是否发挥作用,在COCs体外培养体系中添加或不添加17β-E_2,分别在COCs体外培养的0,6,24 h检测卵丘细胞和卵母细胞间TZPs的表达数量,发现在体外培养6h和24 h时,所有COCs卵丘细胞和卵母细胞之间TZPs数量均显着下降(P<0.05),其中体外培养6 h时17β-E_2处理组与不添加17β-E_2的对照组相比没有明显差异,而培养24 h时17β-E_2处理组TZPs表达数量与对照组相比显着下降(P<0.05),提示17β-E_2并不是通过影响COCs中TZPs的表达而调控卵母细胞核成熟进程。为了进一步验证间隙连接在17β-E_2促进卵母细胞提前发生GVBD中是否发挥作用,在添加1μg/mL 17β-E_2的培养体系中培养山羊COCs,在培养前及培养到2,4,6,8 h时,采用显微操作系统分别将荧光黄(lucifer yellow,LY)注入到卵母细胞胞质中,根据荧光黄从卵母细胞向卵丘细胞的扩散程度,监测不同培养时间COCs的间隙连接通讯功能,结果显示从卵泡新鲜分离的山羊COCs间隙连接有87.5%处于开放状态,17β-E_2处理4h和6h间隙连接通讯明显下调(P<0.05);向COCs培养体系中分别添加1μg/mL 17β-E_2或雌激素膜受体激动剂G1,或联合添加17β-E_2和雌激素膜受体抑制剂,或联合添加17β-E_2和雌激素核受体抑制剂ICI182780,在COCs体外培养的4 h,将COCs转移到含钙黄绿素乙酰甲基酯(Calcein-AM)的磷酸盐缓冲液中,监测钙黄绿素从卵丘细胞向卵母细胞的转移情况,检测雌激素受体通路对间隙连接通讯活性的影响。结果显示,单独添加17β-E_2或雌激素膜受体激动剂G1均能下调间隙连接活性、显着抑制钙黄绿素从卵丘细胞向卵母细胞的转移(P<0.05);膜受体抑制剂G15的添加阻断了雌激素对间隙连接的抑制作用,而不影响钙黄绿素转移;雌激素核受体抑制剂ICI182780的添加不影响17β-E_2对钙黄绿素转移的抑制作用。说明17β-E_2会下调COCs中卵丘细胞与卵母细胞间间隙连接通讯,这种下调作用是通过雌激素膜受体GPR30介导的。(3)为了研究雌激素对山羊COCs卵丘细胞和卵母细胞间间隙连接通讯影响的机制,利用Western Blotting技术,检测17β-E_2对山羊COCs间隙连接蛋白CX43磷酸化水平的影响。结果显示,在17β-E_2处理的4 h内COCs间隙连接蛋白CX43磷酸化水平没有明显变化,在处理到4 h,6 h和8 h时CX43磷酸化水平均显着升高;进一步研究发现,单独使用17β-E_2或雌激素膜受体GPR30激动剂G1处理COCs 4 h后,COCs中GPR30信号通路关键分子细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular-signal regulated protein kinase1/2,ERK1/2)和CX43 Ser368磷酸化水平显着高于空白对照组和17β-E_2与G15共同处理组;进一步在1μg/mL 17β-E_2基础上,共同添加ERK抑制剂PD98059(50μM),或共同添加GPR30信号通路中另一个关键分子EGFR(ERK上游)的抑制剂AG1478(50μM)时,均能下调ERK1/2和CX43 Ser368的磷酸化水平(P<0.05);而17β-E_2与雌激素核受体抑制剂ICI182780共同处理时,ERK1/2和CX43 Ser368的磷酸化水平与对照组没有显着差异。说明,雌激素通过GPR30介导山羊COCs间隙连接蛋白CX43的磷酸化,且EGFR-ERK1/2信号通路参与了这一过程。(4)为了进一步验证EGFR通路参与了GPR30介导的雌激素对COCs间隙连接蛋白CX43磷酸化调控。利用qRT-PCR技术,检测山羊卵丘细胞EGFR的配体EGF样因子(AREG,EREG,BTC)的表达。结果显示,单独添加17β-E_2或者雌激素膜受体激动剂G1处理4 h,均能增加卵丘细胞中EGF样因子的m RNA表达,且显着高于空白对照组和雌激素膜受体抑制剂G15与17β-E_2共同处理组(P<0.05);而雌激素核受体抑制剂ICI182780与17β-E_2共同处理组与单独添加17β-E_2或者G1处理组没有明显差异,说明并ICI182780不影响17β-E_2诱导的卵丘细胞EGF样因子的表达。说明,17β-E_2通过GPR30介导而促进了EGF样因子mRNA表达。综上所述,17β-E_2通过GPR30促进山羊COCs卵丘细胞EGF样因子的表达,进而激活ERK1/2信号通路,促进COCs的间隙连接蛋白CX43的磷酸化、下调间隙连接通讯,最终促进了卵母细胞核成熟进程。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2018-05-01）
文海若,刘倩,王丹,王雪[2]（2017）在《芫花素和染料木黄酮的细胞间隙连接通讯抑制机制研究》一文中研究指出目的:细胞间隙连接通讯(GJIC)在细胞的生长与分化等生理过程中发挥着重要调节作用,研究提示大多数转化细胞和肿瘤细胞的GJIC功能减弱或消失。课题组前期研究发现芫花素和染料木黄酮可诱导Bhas 42细胞转化,有潜在的非遗传毒性致癌性。本研究通过Western Blotting和Real-time PCR方法探究GJIC在芫花素和染料木黄酮诱导Bhas 42细胞转化中的作用。(本文来源于《中国毒理学会中药与天然药物毒理专业委员会第二次（2017年）学术交流大会论文集》期刊2017-10-27）
王苗娟,陈瑜,殷瑛[3]（2016）在《抗肝癌合剂对人肝癌细胞凋亡及间隙连接通讯功能的影响》一文中研究指出目的探讨抗肝癌合剂(IPAH)对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞凋亡和间隙连接通讯功能的影响。方法制备抗肝癌合剂含药血清,分为高、中、低剂量组,另设阴性对照组和空白血清对照组。培养人肝癌细胞株SMMC-7721进行体外实验,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,荧光漂白恢复实验(FRAP)观察对细胞间隙连接通讯功能的影响。结果抗肝癌合剂中剂量组24、48、72h细胞凋亡率分别为(8.07±1.12)%、(12.04±2.12)%、(17.90±1.74)%;高剂量组24、48、72h细胞凋亡率分别为(11.54±2.23)%、(18.29±2.39)%、(22.90±2.43)%,与阴性对照组[(2.42±1.15)%、(2.98±0.92)%、(3.35±0.67)%]及空白对照组[(3.01±1.07)%、(3.88±0.97)%、(4.09±1.23)%]比较,差异有统计学意义(P均<0.01)。抗肝癌合剂低、中、高剂量组荧光恢复率分别为(22.43±2.62)%、(42.73±4.36)%、(49.40±5.13)%,随着时间和剂量增加,荧光恢复率明显增加,组间差异有统计学意义(P均<0.01)。结论抗肝癌合剂具有诱导肝癌细胞系SMMC-7721细胞凋亡的作用,呈一定的剂量和时间依赖关系。其作用可能与上调细胞间隙连接通讯功能相关。(本文来源于《浙江中西医结合杂志》期刊2016年09期）
温丽娜,罗昭逊,莫非,张姝,张婉颖[4]（2015）在《头花蓼对幽门螺旋杆菌相关性胃炎的细胞间隙连接通讯功能的影响》一文中研究指出目的探讨头花蓼对幽门螺旋杆菌相关性胃炎的胃黏膜上皮细胞株-GES-1细胞间隙连接通讯功能的影响。方法采用划痕标记荧光染料示踪技术检测不同比例(幽门螺旋杆菌与细胞之比为25∶1,50∶1,100∶1)的幽门螺旋杆菌数对胃黏膜上皮细胞株-GES-1细胞作用24h后间隙连接通讯功能的影响。构建幽门螺旋杆菌相关性胃炎(Helicobacter pylori-associated gastritis,HPAG)细胞模型基础上,采用划痕标记荧光染料示踪技术检测不同浓度的头花蓼(8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、64μg/mL)作用24h后对幽门螺旋杆菌相关性胃炎的细胞间隙连接通讯功能的影响。结果 (1)通过划痕标记荧光染料示踪技术检测结果表明细菌与细胞之比为50∶1作用24h时,减弱了胃黏膜上皮细胞株-GES-1细胞间隙连接通讯功能(P<0.05);(2)通过划痕标记荧光染料示踪技术检测结果表明头花蓼(64μg/mL)作用24h改善了幽门螺旋杆菌相关性胃炎细胞模型的细胞连接通讯功能(P<0.05)。结论头花蓼(64μg/mL)作用24h改善了幽门螺旋杆菌相关性胃炎细胞模型的细胞连接通讯功能,为头花蓼对H.pylori相关性胃炎的抗菌、抗炎机制奠定了实验基础。(本文来源于《贵州医药》期刊2015年03期）
王宜安,黄沁怡,徐辉,周婷婷,黄攀[5]（2015）在《玉米赤霉烯酮对TM3细胞原癌基因及细胞间隙连接通讯的影响》一文中研究指出为探讨玉米赤霉烯酮(ZEA)的雄性生殖毒性及其机制,本试验以TM3细胞为材料,加入不同浓度的ZEA,设对照组,5、10、20μg/L ZEA染毒组,培养72h后,应用噻唑蓝比色法(MTT)检测TM3细胞活力,免疫印迹法检测原癌基因c-myc、c-fos、c-jun及连接蛋白Cx43、P-Cx43蛋白的表达情况,应用划痕标记染料示踪(SLDT)技术观察GJIC功能的变化,同时通过免疫荧光观察Cx43在细胞内的分布情况。结果显示,各ZEA染毒组对TM3细胞生长有一定的促进作用;免疫印迹检测发现,与对照组相比,10、20μg/L染毒组c-fos的表达量明显升高(P<0.05),5、10、20μg/L染毒组c-myc、c-jun表达量极显着增加(P<0.01),而连接蛋白Cx43表达量在10μg/L染毒组中显着下降(P<0.05),在20μg/L染毒组中极显着下降(P<0.01),其磷酸化水平在20μg/L染毒组显着下降(P<0.05);荧光显微镜观察到10、20μg/L染毒组荧光黄(LY)在细胞间的扩散距离较对照组有极显着下降(P<0.01);ZEA染毒后,分布于细胞膜上的Cx43逐渐减少,出现在细胞质和细胞核上。结果表明,低浓度的ZEA即可诱发Cx43及其磷酸化水平的下调,Cx43在细胞内的异常分布,导致GJIC的功能受到抑制,同时引起原癌基因c-myc、cfos、c-jun异常的表达,低浓度的ZEA对TM3细胞的增殖产生了明显的促进作用。(本文来源于《中国兽医学报》期刊2015年03期）
俞星,郑春姬,李美子,韩春姬[6]（2014）在《发酵轮叶党参正丁醇萃取物对细胞间隙连接通讯的影响》一文中研究指出[目的]探讨发酵轮叶党参正丁醇萃取物对细胞间隙连接通讯(GJIC)的影响.[方法]利用划痕染料示踪技术,在荧光倒置显微镜下观察细胞传递的距离,探讨发酵轮叶党参正丁醇萃取物对大鼠乳鼠肝细胞GJIC功能的影响.[结果]TPA组染料扩散距离明显低于正常对照组及4个不同质量浓度给药组(P<0.01);与正常对照组比较,400mg/L与250mg/L给药组染料扩散距离差异均有统计学意义(P<0.01).[结论]发酵轮叶党参正丁醇萃取物对GJIC功能有促进作用.(本文来源于《延边大学医学学报》期刊2014年04期）
刘耀,张曦,陈幸华,孔佩艳,高蕾[7]（2014）在《全反式维甲酸通过Cx43介导的间隙连接细胞间通讯功能对白血病骨髓基质细胞的作用及机制研究》一文中研究指出目的研究全反式维甲酸对白血病骨髓基质细胞上Cx43表达及GJIC功能的作用,并评价上调GJIC功能后对白血病骨髓基质细胞生物学特性及造血调控能力的影响。方法体外培养白血病患者及正常志愿者骨髓基质细胞,加入不同剂量的全反式维甲酸,使用间隙连接阻断剂两性霉素B作为阴性对照。通过实时定量逆转录PCR检测Cx43 m RNA表达,流式细胞仪、激光共聚焦检测Cx43蛋白表达;染料传输实验及荧光漂白后恢复试验检测间隙连接功能变化;通过流式细胞仪、激光共聚焦显微镜、ELISA和DAPI荧光染色法检测上调间隙连接功能后白血病骨髓基质细胞的细胞周期、凋亡、生长因子分泌能力及细胞内钙离子浓度变化。结果全反式维甲酸作用下,白血病骨髓基质细胞Cx43表达和间隙连接功能增强。间隙连接功能增强后增加了白血病骨髓基质细胞的凋亡率、阻抑了细胞周期进程、减少了GM-CSF和SCF的分泌,提高了细胞内钙离子浓度。结论全反式维甲酸可增强白血病骨髓基质细胞上原本低表达的Cx43和间隙连接通道功能,进而改变白血病骨髓基质细胞的生物学特性和造血调控能力。(本文来源于《第四届全国血液肿瘤学术大会暨第七届全国淋巴肿瘤诊治进展研讨会论文汇编》期刊2014-10-23）
夏晨,傅韵,李正东,蒋蓓琪,成小林[8]（2014）在《LKB1通过增强间隙连接细胞通讯增加乳腺癌细胞对顺铂的敏感性》一文中研究指出目的研究LKB1对乳腺癌细胞顺铂化学敏感性的作用及机制。方法构建LKB1高表达的稳定转染细胞MDA-MB-231/LKB1及其空载对照细胞MDA-MB-231/VEC。RT-PCR、Western印迹法检测细胞间隙连接蛋白Cx26、Cx32、Cx43和Cx50的核酸、蛋白水平表达;免疫荧光实验对Cx43进行胞内表达定位;染料传输实验评估间隙连接细胞通讯功能;细胞毒实验检测顺铂杀伤乳腺癌细胞的"旁观者效应"及计算顺铂的半数抑制浓度。结果 LKB1增加了间隙连接蛋白Cx43的核酸及蛋白水平表达(P<0.01),但对Cx26、Cx32及Cx50的表达水平无明显影响。LKB1增加了细胞膜上Cx43的表达,增强了细胞传递荧光黄染料的能力,并使顺铂对细胞的旁观者杀伤效应增强。LKB1也增加了细胞对顺铂的敏感性,MDA-MB-231、MDA-MB-231/VEC和MDA-MB-231/LKB1的半数抑制浓度分别为22.46、24.72、6.55 nmol/L,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 LKB1通过增强乳腺癌细胞的Cx43表达及间隙连接细胞通讯功能增强了顺铂的旁观者杀伤效应,并增加了细胞对顺铂的敏感性。(本文来源于《同济大学学报(医学版)》期刊2014年04期）
郭庶[9]（2014）在《铅诱导PC12细胞旁观者效应及细胞间隙连接通讯（GJIC）作用研究》一文中研究指出研究背景铅是工业上常用的重金属之一,可以通过呼吸和消化系统进入人体。铅具有很强的神经毒性,可导致不可逆的神经系统损伤,儿童在发育期对铅暴露产生的毒性尤为敏感。科学家们发现即使儿童的血铅浓度保持在可接受水平,儿童的智力发育仍会受到明显影响。因此,铅的神经毒性受到了广泛关注。细胞生长的微环境是保持细胞正常增殖、分化、代谢和功能活动的重要条件。细胞对外界的微环境非常敏感,在同一共培养体系中,细胞之间或细胞与胞外基质之间的直接接触可以影响细胞的生长状态。近几十年来,在放射生物学领域发现,当少数细胞受到射线照射时,没有受到射线直接照射的周围细胞也能表现出一些损伤效应。大量研究已经证明在体内和体外实验中确实存在损伤传递效应。例如,慢性粒细胞白血病患儿的脾部在接受放射线照射治疗时,胸骨骨髓细胞发生了损伤；局部氧化损伤可以通过GJIC在内皮细胞之间传递。有人提出用肿瘤自杀基因治疗肿瘤,当部分肿瘤细胞转染自杀基因后,在药物启动转染细胞自杀后,转染细胞及周围未转染细胞均被杀灭。近年来,有人发现局部氧化损伤可以通过细胞间缝隙连接通讯(GJIC)在上皮细胞间传递。以上所述存在着一个共同的现象,就是某些有害因素引起的靶细胞损伤不仅仅局限于靶细胞本身,还可以引起周围正常细胞产生损伤。暴露于有害因素的细胞群会h出现明显的生物效应,这种效应在暴露细胞群和周围未暴露细胞群都会发生,这一现象人们称之为旁观者效应(bystander effect,BE)。旁观者效应是指正常细胞在直接受到有害因素损害的靶细胞诱导下发生的诸如细胞死亡、基因突变、染色体不稳定等反应,这些经诱发而发生效应的正常细胞成为旁观者细胞。由于旁观者效应的存在,使靶细胞的损伤效应得以延续与放大,从而使损伤明显加重。这些研究提醒人们：机体对损伤的反应不仅仅是单个独立细胞或者组织,而是具有群体性。对于旁观者效应的发现已有几十年,但至今为止,旁观者效应的确切机制尚未阐明。越来越多研究表明,旁观者效应可能与缝隙连接蛋白(connexin, Cx)介导的细胞间隙连接通讯(gap-junctional intercellular communication, GJIC)有密切关系。缝隙连接蛋白是构成细胞间缝隙连接通道基本结构和功能的一类膜蛋白。由六个穿膜的缝隙连接蛋白组成中空的亲水性六聚体结构叫做连接小体(connexon)或缝隙连接半通道(gap junction hemichannel)。在正常情况下,细胞膜对应面上的一对连接小体组成了GJ通道,它能允许分子量低于1KD或直径小于1.5nm的小分子物质如代谢分子、离子、第二信使(如Ca2+、ATP)等通过,这些小分子参与细胞间物质交换的代谢藕联和电信号传递的电藕联,进行细胞间信息传递,从而在细胞的分化、生长、生理功能的调节中发挥重要作用。铅毒物可增加细胞内活性氧簇(ROS)的水平,同时减少抗氧化物质的浓度活性,破坏氧化、抗氧化平衡,导致氧化损伤,诱发细胞凋亡。同时铅还可通过影响一些相关基因的表达,影响细胞凋亡。目前铅诱导细胞凋亡机理的研究已经取得了许多进展,但尚不完善,铅中毒是否会发生旁观者效应未见报道,铅中毒的毒性代谢产物能否通过间隙连接细胞间通讯(GJIC)进行传导等问题仍有待于深入研究。综上所述,我们选择神经元模式细胞-大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PCl2)为研究对象,希望通过对染毒细胞与未染毒细胞共培养体系的研究,对醋酸铅诱导PC12细胞旁观者效应的过程有一个系统、完整的认识,同时为防治铅中毒的下一步研究提供依据。研究目的：1、利用直接接触混合共培养技术,构建可以区分醋酸铅染毒与未染毒PC12细胞的共培养体系；2、通过混合共培养体系,观察醋酸铅染毒PC12细胞对周边正常PC12细胞的影响；3、研究缝隙连接蛋白介导的细胞间缝隙连接是否参与醋酸铅诱导的旁观者效应,旨在探讨醋酸铅诱导PC12细胞旁观者效应可能的毒理机制。研究方法：1、确定醋酸铅的细胞毒性并筛选适合诱导PC12旁观者效应的醋酸铅浓度(1)细胞增殖能力检测按照醋酸铅浓度将细胞分成5个实验组(0、0.01、0.1、1、10、100μM),通过MTT比色法,检测不同浓度醋酸铅对PC12细胞增殖能力的影响。分别以每孔5x103个细胞接种到96孔板,暴露于不同浓度的醋酸铅,每孔加MTI镕液20ul,继续培养24h后终止培养,弃培养上清液,每孔加150ul二甲基亚砜(DMSO),置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分融解,选择490nm波长,通过酶联免疫监测仪测定各孔光吸收值。(2)ROS水平检测将PC12细胞分成2个实验组：PC12、PC12(10μM Pb处理)。各组细胞孵育24h融合后进行实验,弃培养液,室温下D-Hank's漂洗3次,加入含有10μMDHE荧光探针无血清DMEM培养液1mL,37℃避光孵育20min,用无血清培养液洗涤细胞3次,0.25%胰蛋白酶消化,加入1mL无血清培养液吹打均匀,染色完毕后进行Hoechst33342染色。通过荧光显微镜,观察细胞内ROS水平检测。激发波长480～535nm,最大发射波长590nm～610nm; Hoechst33342的最大激发波长为350nm,最大发射波长为460nm。(3)凋亡相关蛋白检测按照醋酸铅浓度将细胞分成5个实验组(0、0.01、0.1、1、10、100μM),通过RT-PCR,检测凋亡相关基因(Bax, Bcl-2)的mRNA表达水平,以β-actin做内参照。根据NCBI所提供的基因序列,通过引物设计软件Primer3设计相应引物,扩增条件为预变性：94℃for5min;变性94℃30s,退火60℃30s,延伸72℃1mmin,30个循环；后延伸72℃5min。(4)细胞凋亡检测按照醋酸铅浓度将细胞分成5个实验组(0,0.01,0.1,1,10,100μM),通过Annexin v-PE/7-AAD试剂盒,检测PC12细胞凋亡情况。收集1～5×105细胞；加入500μL的Binding Buffe悬浮细胞；加入1μL Annexin V-PE混匀；室温、避光、反应5～15min；加入5μL7-AAD染液,混匀；室温、避光、反应5-15min；在1h内完成流式细胞仪的检测。(5)线粒体跨膜电位将细胞分成3个实验组：PC12、GFP-PC12、GFP-PC12(10μM Pb处理)将各组细胞培养24h后,分别加入20nM TMRM,通过流式细胞仪检测线粒体跨膜电位。(6)NAC处理将细胞分成3个实验组：PC12、PC12+10μM Pb、PC12(NAC处理)+10μMPb,分别检测各组细胞ROS、线粒体膜电位、凋亡水平(方法同上)。2、构建染毒细胞与正常细胞共培养体系,并观察检测醋酸铅诱导PC12旁观者效应(1)构建EF1A-eGFP稳定转染PC12细胞株将处于对数生长期的PC12细胞吸去培养液,用PBS洗涤后加入适量Trypsin-EDTA,消化后移至离心管中,取1×105cells/9.6cm2的密度接种至六孔板,待细胞完全贴壁后,即可进行转导。转导前,每孔细胞换成1.5mL新鲜的HD+10%FBS培养基或1640+20%FBS培养基,每株各选取一孔细胞加入30μL的Lenti-eGFP/Neo,充分的摇匀后放入37℃、5%CO2、95%相对湿度的培养箱中培养。转导7小时后,吸去含有Lenti-eGFP/Neo的完全培养基,换成新鲜的HD+10%FBS培养基或1640+20%FBS培养基,放入37℃、5%CO2、95%相对湿度的培养箱中培养。转导48小时后,于荧光显微镜下观察转导效果。(2)细胞混合培养荧光显微镜观测将PC12、GFP-PC12按比例混合培养,用PBS制备50μM Hoechst33342染料,在37℃培养细胞20分钟,用PBS冲洗细胞两次,用带有350nm激发波长,460nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。(3)共培养体系ROS水平、凋亡水平、线粒体跨膜电位检测：将细胞分成2个实验组组：GFP-PC12+PC12、GFP-PC12(10μMPb处理)+PC12。分别进行ROS水平、凋亡水平、线粒体跨膜电位检测(方法同上)。3、GJIC在醋酸铅诱导PC12旁观者效应中的作用研究(1)共培养体系缝隙连接功能检测将细胞分成2个实验组：GFP-PC12(10μMMPb处理)+PC12、GFP-PC12(10μMPb处理)+PC12+CBX;通过细胞接种荧光示踪法(Parachute Assay)检测细胞间荧光传递功能,即细胞GJ功能。(2) GJIC阻断剂甘珀酸(CBX)对旁观者效应的影响将细胞分成2个实验组:GFP-PC12+PC12、GFP-PC12(10μMPb处理)+PC12、GFP-PC12(10μMPb处理)-PC12+CBX。分别进行ROS、凋亡、线粒体跨膜电位检测(方法同上)。4、数据处理上述实验至少重复叁次。各组间的检验如方差齐则采用单因素方差分析,两两比较采用LSD方法；如方差不齐则采用Welch方法,两两比较采用Dunnett-T3方法,实验结果以平均值±标准差表示。全部实验数据采用SPSS19.0统计软件进行分析,p<0.05视为差异具有统计学意义。主要结果：1、醋酸铅引起PC12细胞增殖能力显着下降,凋亡水平上升。MTT法检测结果显示各剂量组细胞活性之间有显着性差异(F值=386.421,P=0.000),其中暴露于1μm醋酸铅的PC12细胞增殖能力降低(95.0%±3.8%),与对照组比较有显着性差异(P=0.04),而暴露于10μM和100μm醋酸铅的PC12细胞增殖能力分别为69.8%±2.8%和51.4%±3.8%(P=0.00；P=0.00)。流式细胞仪结果显示,0.1μM、1μM、10μM, and100μM暴露组的凋亡率分别为1.33%±0.42%,5.40%±0.51%,38.33%±3.06%,46.67%±4.51%。说明随着醋酸铅染毒浓度的升高,细胞的增殖能力逐渐下降,凋亡水平逐步升高。2、醋酸铅引起PC12细胞凋亡相关基因Bax表达上升,Bcl-2表达下降,Bax/Bcl-2比值上升,并呈剂量反应关系。RT-PCR分析结果显示,各剂量组细胞Bax基因mRNA表达之间有显着性差异(Welcl值=103.674,P=0.000),其中1μM、10μM、100μM组细胞Bax基因mRNA表达与对照组细胞比较有显着性差异(P=0.011；P=0.034；P=0.008),说明随着醋酸铅浓度增高,细胞Bax基因mRNA表达逐渐下降。各剂量组细胞Bcl-2基因mRN表达之间有显着性差异(Welch值=363.691,P=0.000),其中10μ M、100μm组细胞Bcl-2基因,mRJA表达与对照组细胞比较有显着性差异(P=0.049；P=0.027),说明随着醋酸铅浓度增高,细胞Bcl-2基因mRNA表达逐渐升高。3、抗氧化剂N-乙酰基半胱氨酸(NAC)可以抑制醋酸铅引起的ROS水平增高、线粒体跨膜电位降低及细胞凋亡。经过NAC预处理后,荧光显微镜下,NAC预处理组ROS生成水平明显低于未处理组(P=0.000)；线粒体跨膜电位NAC预处理组高于未处理组(P=0.000)；暴露10μM醋酸铅的PC12细胞凋亡率下降至14.33%±1.53%。4、通过EF1A-EGFP稳定转染PC12细胞,构建了共培养体系,在荧光显微镜下可以区分染毒与未染毒细胞。荧光显微镜下,稳定转染PC12细胞呈现绿色加蓝色核染,而正常细胞仅为蓝色核染。5、细胞荧光免疫示踪法(Parachute Assay)显示GFP-PC12(Pb2+)细胞和PC12细胞之间建立了细胞间隙连接通讯。荧光显微镜下稳定转染PC12细胞将绿色染料传递给周围正常细胞,CBX可以有效组织这种传递。说明稳定转染PC12细胞与正常细胞之间建立了缝隙连接。6、GJIC阻断剂甘珀酸(CBX)可以部分阻断醋酸铅诱发的旁观者效应在共培养体系中,ROS水平GJIC阻断剂甘珀酸(CBX)处理前PC12细胞的(3.48±0.59),处理后为(1.64±0.42),差异有显着性(P=0.000)。凋亡水平GJIC阻断剂甘珀酸(CBX)处理前为(43.52%±8.07%),处理后为(12.19%±1.13%),差异有显着性(P=0.000)。线粒体跨膜电位处理前低于处理后。结论：1、醋酸铅可诱导PC12细胞凋亡的线粒体途径。2、醋酸铅对PC12细胞造成的损伤可以传递给周围正常细胞。3、细胞间隙连接通讯GJIC在铅诱导的旁观者效应中起了重要的作用。(本文来源于《南方医科大学》期刊2014-03-20）
古威鹏,夏莹莹,晁璐,潘楚洁,吴继国[10]（2013）在《甲基对硫磷对小鼠黄体细胞的细胞间隙连接通讯和孕酮分泌的影响》一文中研究指出目的探索甲基对硫磷(methyl parathion,MP)对小鼠黄体细胞的细胞间隙连接通讯(gap junctional intercellular communication,GJIC)和孕酮分泌的影响。方法体外培养5周龄SPF级BALB/c小鼠黄体细胞,分别设MP暴露组(0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mmol/L的MP处理3 h)和GJIC促进剂——1μmol/L异丙肾上腺素预处理组及蛋白激酶A(PKA)专一抑制剂——10μmol/L H89预处理组与蛋白激酶C(PKC)专一抑制剂——10μmol/L恩扎妥林预处理组(预处理5 min,0.8 mmol/L MP处理3 h)。采用ELISA法检测培养液中孕酮含量,划痕标记染料转移法测定贴壁细胞的GJIC。结果高浓度(0.2~1.6 mmol/L)MP可明显抑制小鼠黄体细胞的GJIC和孕酮分泌(P<0.05);异丙肾上腺素、H89和恩扎妥林均能缓解MP对体外小鼠黄体细胞的GJIC和孕酮分泌的抑制作用(P<0.05)。结论 MP可通过抑制小鼠黄体细胞的GJIC导致孕酮分泌受抑制,而PKA与PKC参与该过程。(本文来源于《环境与健康杂志》期刊2013年08期）
间隙连接通讯论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的:细胞间隙连接通讯(GJIC)在细胞的生长与分化等生理过程中发挥着重要调节作用,研究提示大多数转化细胞和肿瘤细胞的GJIC功能减弱或消失。课题组前期研究发现芫花素和染料木黄酮可诱导Bhas 42细胞转化,有潜在的非遗传毒性致癌性。本研究通过Western Blotting和Real-time PCR方法探究GJIC在芫花素和染料木黄酮诱导Bhas 42细胞转化中的作用。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
间隙连接通讯论文参考文献
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