论文摘要
致病杆菌属（Xenorhabdus sp.）是一类与斯氏线虫（Steinernema sp.）互惠共生的昆虫病原共生菌,能够分泌多种杀虫、抑菌和抗肿瘤的活性代谢产物,干扰宿主的免疫反应,导致昆虫宿主死亡。课题组在前期研究中,通过对X.stockiae HNxs01菌株进行Fosmid基因组文库的构建,从中筛选出复合毒素SrfABC,对昆虫细胞和肿瘤细胞均具有明显毒性,并且发现三组分蛋白之间具有相互作用。本文对SrfABC复合毒素各组分的活性及其作用机理进行了研究,为该类毒素在致病杆菌对昆虫致病及抗肿瘤活性中的功能奠定了基础。本研究利用GST标签单独表达载体在大肠杆菌中表达SrfA、SrfB、SrfC蛋白,通过生测实验发现SrfA、SrfB、SrfC蛋白对棉铃虫均具有注射毒性,且三者混合时毒性最大。我们以枞色卷蛾中肠细胞系CF-203/2.5和人宫颈癌细胞系HeLa为作用靶标,利用倒置显微镜和MTT法发现SrfA、SrfB、SrfC蛋白均能导致肿瘤细胞和昆虫细胞皱缩死亡,具有明显细胞毒性,且三者混合作用时毒性最大。通过Hoechst/PI双染和流式细胞仪检测发现SrfA、SrfB、SrfC蛋白均能破坏CF-203/2.5细胞的细胞膜完整性,造成细胞凋亡,且三者混合作用时对细胞膜完整性破坏最大,凋亡率最高,并且三种蛋白均能将细胞周期阻滞在G2/M期。接下来,我们对SrfABC毒素各组分在细胞中的定位进行了研究。免疫荧光结果显示:CF203细胞中,SrfA、SrfB、SrfC蛋白单独或混合作用,均集中分布在细胞质;在HeLa细胞中,SrfA蛋白集中分布在细胞质,SrfB蛋白集中分布在细胞核,SrfC蛋白单独作用时分布在细胞质,混合作用时从细胞质转移至细胞核。通过Western blot验证了SrfA、SrfB、SrfC蛋白单独或混合作用,均能较高效率的、主动进入昆虫细胞和肿瘤细胞。为了研究SrfABC毒素各组分的作用机制,我们将SrfA,SrfB,SrfC分别转染至肿瘤细胞HeLa和昆虫细胞Sf9中。实验表明:SrfA,SrfB,SrfC蛋白均在HeLa细胞中成功表达;利用免疫沉淀及质谱技术筛选出其结合蛋白主要为骨架蛋白;Western Blot检测显示:SrfA蛋白转染进HeLa细胞后,除了目的条带外,还检测到分子量大于SrfA蛋白的条带,推测是SrfA蛋白在肿瘤细胞中的表达发生翻译后修饰,通过定点突变和糖苷酶处理,初步排除了糖基化修饰的可能性。本文探究了SrfABC毒素对人肿瘤细胞和昆虫细胞的细胞毒性,探明各组分的定位。初步分析了三元复合毒素的酶活性组分,初步研究了SrfABC类毒素在细胞内发挥毒性的作用机理,为该类毒素在致病杆菌对病原微生物抵抗宿主防御、毒力发挥及宿主定殖中的研究提供理论依据。
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摘要ABSTRACT第一章 引言 1.1 致病杆菌的研究背景 1.2 致病杆菌中的活性物质 1.2.1 杀虫毒素蛋白 1.2.2 天然抗肿瘤物质 1.2.3 其它活性产物 1.4 昆虫病原线虫共生菌的应用 1.5 立题依据和意义第二章 材料与方法 2.1 材料 2.1.1 质粒、菌株和细胞 2.1.2 培养基和抗生素 2.1.3 主要试剂及试剂盒 2.1.4 引物 2.1.5 仪器设备 2.2 实验方法 2.2.1 SrfA、SrfB、SrfC蛋白的分离纯化 2.2.2 SrfA、SrfB、SrfC蛋白的细胞毒性分析 2.2.2.1 倒置显微镜观察细胞毒性特征 2.2.2.2 MTT 测定不同组分纯化蛋白对细胞的生长抑制作用 2.2.3 Western blot检测 SrfA、SrfB、SrfC蛋白在细胞内的表达情况 2.2.4 免疫荧光观察 SrfA、SrfB、SrfC蛋白在细胞内的定位 2.2.5 Hoechst/PI双染探究SrfA、SrfB、SrfC蛋白对细胞凋亡的影响 2.2.6 流式细胞仪检测SrfA、SrfB、SrfC蛋白对细胞凋亡的影响 2.2.7 流式细胞仪检测SrfA、SrfB、SrfC蛋白对细胞周期的阻滞 2.2.8 质谱鉴定SrfA、SrfB、SrfC蛋白在He La细胞中的结合蛋白 2.2.8.1 转染 2.2.8.2 免疫沉淀 2.2.8.3 胶内酶解 2.2.9 SrfA蛋白在He La细胞中具体修饰分析 2.2.9.1 携带Flag标签的突变质粒的构建及鉴定 2.2.9.2 Western Blot检测SrfA蛋白在He La中的具体修饰 2.2.10 昆虫表达系统中重组质粒的构建及鉴定 2.2.11 重组质粒转染昆虫细胞 2.2.12 SrfA、SrfB、SrfC蛋白杀虫活性测定第三章 结果和分析 3.1 SrfA、SrfB、SrfC蛋白的纯化 3.2 SrfA、SrfB、SrfC蛋白的细胞毒性分析 3.2.1 倒置显微镜观察细胞毒性特征 3.2.2 MTT检测SrfA、SrfB、SrfC蛋白对细胞的抑制率 3.3 免疫荧光观察SrfA、SrfB、SrfC蛋白在细胞内的定位 3.4 Western Blot检测SrfA、SrfB、SrfC蛋白表达情况 3.5 Hoechst/PI双染探究SrfA、SrfB、SrfC蛋白对细胞凋亡的影响 3.6 流式细胞仪检测SrfA、SrfB、SrfC蛋白对细胞凋亡的影响 3.7 流式细胞仪检测SrfA、SrfB、SrfC蛋白对细胞周期的阻滞 3.8 免疫沉淀分离SrfA、SrfB、SrfC蛋白的结合蛋白 3.9 质谱鉴定SrfA、SrfB、SrfC蛋白的结合蛋白 3.10 携带Flag标签的突变质粒的构建及鉴定 3.11 Western Blot检测SrfA蛋白在He La细胞中的修饰 3.12 昆虫表达系统中重组质粒的构建及鉴定 3.13 重组质粒转染昆虫细胞形态形态影响的观察 3.14 SrfA、SrfB、SrfC蛋白注射毒力测定第四章 讨论 4.1 SrfABC毒素蛋白的昆虫细胞和肿瘤细胞毒性分析 4.2 SrfA、SrfB、SrfC蛋白在肿瘤细胞中表达后活性分析 4.3 SrfA、SrfB、SrfC蛋白在真核表达系统的选择第五章 结论与展望参考文献课题受资助的项目致谢
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 杨曦
导师: 胡胜标
关键词: 致病杆菌,细胞毒性,毒素,酶活性组分,翻译后修饰
来源: 湖南师范大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 湖南师范大学
基金: 发光杆菌新型双元毒素PnfAB细胞受体的鉴定及作用机理研究(湖南省自然科学基金,14JJ6009),致病杆菌中SrfABC三元复合毒素的生物活性及作用机理研究(国家自然科学基金,31570125)
分类号: Q93
总页数: 70
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标签：致病杆菌论文; 细胞毒性论文; 毒素论文; 酶活性组分论文; 翻译后修饰论文;
