棉花（Gossypium hirsutum）遗传转化及LIM基因在转基因棉花后代中的功能研究

论文摘要

棉花是世界上最重要的纤维作物,棉花生产与农业、手工业、贸易业等多个行业的发展关系十分密切,棉纤维的品质决定了棉花的商业生产价值。探讨棉纤维细胞伸长和次生壁合成的分子调控机理,对提高棉纤维品质具有重要的理论意义和实践价值。本实验室在先前的研究中鉴定了 5个LIM蛋白家族基因,获得GhWLIM5和GhXLIM6转基因棉花植株及其后代株系,本文主要对其中两个LIM蛋白在转基因棉花后代株系纤维发育中的功能及其调控机制进行了较为深入的探讨。此外,还对一个在棉纤维细胞次生壁发育时期优势表达的MYB类转录因子基因进行了初步分析,构建载体,转化棉花,获得该MYB基因的转基因棉花株系。本文获得的主要研究结果如下:1、抑制Gh WLIM5/GhXLIM6的表达阻碍棉纤维伸长发育为研究LIM蛋白在棉纤维发育中的功能,分析了GhWLIM 和GhXLIM6 RNAi转基因棉花后代株系的纤维长度变化等遗传表型。我们测量了不同RNAi棉花后代株系成熟棉纤维长度,统计分析结果显示,与野生型相比,转基因棉花成熟棉纤维长度都不同程度变短。进一步通过离体培养胚珠,测量发育中的棉纤维细胞长度,发现在纤维快速伸长期,转基因棉花纤维生长速度明显慢于野生型。上述结果说明GhWLIM5和GhXLIM6可能在棉纤维伸长阶段发挥正调控作用。2、GhWLIM5和GhXLIM6作为肌动蛋白结合蛋白促进棉纤维中肌动蛋白（F-actin）聚集成束在棉纤维发育过程中,F-actin维持一定聚合程度是必需的。用LatB（F-actin解聚剂）处理野生型棉花胚珠,导致棉纤维发育受阻。用Atto 488-鬼笔环肽对处于快速伸长期的棉纤维中F-actin进行染色观察,结果显示,与野生型棉纤维相比,GhWLIM5和GhXLIM6 RNAi转基因植株棉纤维中,肌动蛋白丝束更细,定量分析结果也显示,这些转基因棉纤维中F-actin聚合度更低。这些结果说明GhWLIM5和GhXLIM6都能够作为肌动蛋白结合蛋白,促进棉纤维细胞中F-actin丝束的形成,从而影响棉纤维伸长发育。3、GhWLIM5和GhXLIM6与F-actin结合能力以及促进F-actin聚合能力存在差异研究表明,不同LIM蛋白对F-actin的结合能力,以及促进F-actin的聚合能力可能存在差异。本文首先通过定量高速共沉淀实验,对GhWLIM5和GhXLIM6蛋白与F-actin的结合能力进行了比较。结果显示,在加入同样浓度的F-actin的情况下,GhXLIM6在沉淀中的比例更高,而GhWLIM5的沉淀量明显低于前者,这表明GhXLIM6与F-actin的结合能力更强。随后,采用低速共沉淀实验比较分析GhWLIM5和GhXLIM6促进F-actin聚合的能力,结果显示添加2μM GhXLIM6即可使70%低聚合度的F-actin聚合成高聚合度的F-actin丝束,而达到同样效果,GhWLIM5需要添加4μM,这说明GhXLIM6促进F-actin聚合的能力强于GhWLIM5。4、pH值对LIM蛋白促进F-actin聚合的影响研究表明,一些LIM蛋白促进F-actin聚合会受到pH值的影响。利用低速共沉淀实验,比较了在不同pH环境下上述两个LIM蛋白促进F-actin聚合的能力。结果显示,加入同样浓度的GhWLIM5,随着pH值下降,处于沉淀中的F-actin 比例不断上升,表明GhWLIM5促进F-actin的聚合受到pH值的影响,pH值越低,促聚合能力越强。相反,实验表明pH值的改变不影响GhXLIM6促进F-actin聚合的能力。5、棉花遗传转化及GhMYBL1转基因棉花植株的鉴定分离鉴定了一个在棉纤维细胞次生壁发育时期优势表达的MYB类转录因子基因,命名为GhMYBL1。构建了GhMYBL1过量表达和RNAi载体,利用农杆菌介导的棉花转化,获得GhMYBL1过量表达和RNAi转基因棉花植株,并对T0代棉花苗进行了阳性鉴定。共获得了30个株系65棵阳性苗,移栽到大田或温室,进一步生长发育至成熟。有关GhMYBL1转基因棉花株系的遗传表型等方面的分析,正在进行中。6、GhMYBL1蛋白重组表达和多克隆抗体制备构建了pET28a-GhMYBL1的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达GhMYBL1蛋白,通过免疫家兔获取GhMYBL1多克隆抗体,Western Blot对抗体的特异性及效价进行了检测,表明该抗体可以用于后续相关的实验研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 一、前言
•   1.1 棉花纤维发育过程及调控机制研究
•     1.1.1 棉花纤维发育过程
•     1.1.2 棉纤维发育的调控机制研究
•   1.2 植物细胞骨架研究进展
•     1.2.1 微管与微管结合蛋白
•     1.2.2 微丝与微丝结合蛋白
•   1.3 棉纤维细胞骨架系统
•   1.4 LIM蛋白家族
•   1.5 植物次生细胞壁转录调控研究进展
•     1.5.1 植物次生细胞壁组分
•     1.5.2 植物次生细胞壁合成的转录调控
•   1.6 棉纤维细胞次生壁发育
•   1.7 立题依据及研究意义
• 二、材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 植物材料
•     2.1.2 载体和菌种
•     2.1.3 化学试剂
•     2.1.4 工具酶
•     2.1.5 常用储液及试剂
•     2.1.6 常用缓冲液
•     2.1.7 共沉淀实验所需试剂
•     2.1.8 其他试剂
•     2.1.9 仪器设备以及DNA合成、测序
•   2.2 棉花叶片基因组DNA的提取及阳性鉴定
•   2.3 棉纤维RNA的提取及逆转录
•   2.4 实时荧光定量PCR
•   2.5 棉花体外胚珠离体胚培养
•   2.6 蛋白质的原核诱导表达与纯化
•     2.6.1 蛋白的原核诱导表达
•     2.6.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
•     2.6.3 重组蛋白的分离与大量纯化
•   2.7 鬼笔环肽染Actin聚合度方法
•   2.8 高、低速共沉淀实验
•     2.8.1 体外装配肌动蛋白纤维
•     2.8.2 共沉淀实验
•   2.9 细菌感受态的制备
• 2法）'>    2.9.1 大肠杆菌Top10感受态细胞的制备（CaCl₂法）
•     2.9.2 农杆菌LBA4404感受态细胞的制备
•   2.10 载体的构建
•   2.11 农杆菌介导的转基因棉花转化
•   2.12 棉花转化的继代管理
• 0代棉花苗基因组的提取及阳性鉴定'>  2.13 GhMYBL1 T₀代棉花苗基因组的提取及阳性鉴定
•   2.14 多克隆抗体的制备与检测
•     2.14.1 GhMYBL1蛋白原核表达与纯化
•     2.14.2 蛋白免疫印记检测（Western blotting）
•     2.14.3 多克隆抗体制备
• 三、实验结果
•   3.1 GhWLIM5 RNAi转基因棉花后代植株的生长发育
•   3.2 GhWLIM5 RNAi转基因棉花后代植株的鉴定及表达量分析
•     3.2.1 转基因棉花阳性苗鉴定
•     3.2.2 GhWLIM5 RNAi转基因棉花中基因表达分析
•   3.3 GhWLIM5 RNAi转基因棉花后代株系的表型分析
• 2代GhWLIM5 RNAi转基因棉花纤维长度的测量'>    3.3.1 T₂代GhWLIM5 RNAi转基因棉花纤维长度的测量
•     3.3.2 GhWLIM5 RNAi棉花离体胚培养及纤维长度测量统计
•     3.3.3 肌动蛋白解聚剂LatB对棉纤维发育的影响
•     3.3.4 GhWLIM5 RNAi转基因棉纤维中F-actin聚合度的观察
•     3.3.5 GhWLIM5 RNAi转基因棉花纤维品质分析
•   3.4 GhXLIM6 RNAi转基因棉花后代株系的表型分析
•     3.4.1 GhXLIM6 RNAi转基因棉花后代株系的成熟棉纤维长度测量
•     3.4.2 GhXLIM6 RNAi转基因棉纤维中F-actin聚合度的观察
•   3.5 GhWLIM5/GhXLIM6蛋白诱导表达与纯化
•   3.6 GhWLIM5和GhXLIM6与F-actin结合能力的比较分析
•   3.7 GhWLIM5和GhXIM6促进F-actin聚合能力的比较
•   3.8 GhWLIM5和GhXLIM6促进F-actin聚合的能力受pH的影响
•   3.9 GhMYBL1过量表达载体和RNAi载体构建及农杆菌转化
•   3.10 棉花遗传转化
•     3.10.1 棉花下胚轴浸染农杆菌
•     3.10.2 抗性筛选及愈伤组织的诱导产生
•     3.10.3 胚性愈伤组织挑选
• 0代棉花苗的移栽'>    3.10.4 练苗与T₀代棉花苗的移栽
•   3.11 转基因棉花植株基因组DNA的提取及阳性鉴定
•   3.12 GhMYBL1蛋白原核诱导表达及多克隆抗体制备
•     3.12.1 pET28a-GhMYBL1蛋白表达载体构建和转化
•     3.12.2 GhMYBL1蛋白表达纯化
•     3.12.3 GhMYBL1蛋白Western Blot检测
•   3.13 GhMYBL1蛋白多克隆抗体制备
• 四、讨论
•   4.1 GhLIM5/6可以促进F-actin聚合从而控制棉纤维的伸长
•   4.2 GhLIM蛋白对F-actin的聚合能力受pH的影响
•   4.3 对GhMYBL1研究方向的展望
• 参考文献
• 硕士期间发表的论文
• 附表
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 高雅

导师: 李扬,李学宝

关键词: 棉花,棉纤维发育,蛋白,肌动蛋白细胞骨架,肌动蛋白结合蛋白,转录因子

来源: 华中师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,农作物

单位: 华中师范大学

分类号: S562;Q943.2

总页数: 84

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