应用CRISR-Cas9在红色糖多孢菌进行基因编辑重构生物合成基因簇的研究

论文摘要

红霉素A（Erythromycin A,ErA）是红色糖多孢菌在次级代谢过程中合成产生的一类大环内酯类抗生素,具有日益增长的临床应用需求。因此,利用基因工程技术改造宿主菌,获得高产菌株,提高其工业产量仍是其研究的重中之重。随着新型基因组编辑技术的发展,改造合成基因簇、调控基因表达等干扰策略越来越受到研究人员的重视。红色糖多孢菌属于高GC含量的放线菌,基于传统的同源双交换原理的基因编辑技术效率低、操作周期长,严重限制了红色糖多孢菌基因改造的进程。对于红霉素A等次级代谢产物产量的提高则需要一种更为高效的基因编辑工具。CRISPR-Cas9系统广泛应用于许多物种的基因编辑,在放线菌属的天蓝色链霉菌中已经有基于CRISPR-Cas9的基因编辑技术,但是红色糖多孢菌中缺乏有效的CRISPR-Cas9编辑工具。本研究应用CRISPR-Cas9高效基因编辑系统对红色糖多孢菌进行基因工程改造,包括敲入组成型强启动子、定点整合增加前体合成的酶,CRISPRi优化代谢流,构建并筛选得到红霉素A高产工业菌株。本研究率先开发了应用于红色糖多孢菌的CRISPR-Cas9基因编辑技术。主要研究内容如下:应用CRISPR-Cas9系统编辑红色糖多孢菌基因组。温敏性质粒骨架上构建PermE启动子驱动的Cas9表达模块;并用Pj23119和PkasO启动子驱动sgRNA的转录,构建由特定sgRNA引导的靶向性CRISPR-Cas9编辑系统。结果表明,应用CRISPR-Cas9基因编辑系统,由单一sgRNA引导的编辑效率为13%,利用双sgRNA靶向的编辑效率提高到65%,并成功应用于无痕敲除indA（SACE1229）。在工业菌株Ab（HP）中敲除SACE1765,使得红霉素产量提高了 12.7%。利用此技术,通过在SACE0712敲入PermE-Flag-egfp,激活了野生菌中的红霉素生物合成基因簇中的部分基因,使得红霉素产量增加了 80.3%。双向启动子Pj23119-PkasO敲入提高红霉素产量。通过mCherry报告基因系统检测红霉素生物合成基因簇的启动子强度,选取SACE0720（eryBIV）-SACE0721（eryAI）间隔区作为靶标调控区域,在Ab（HP）中利用CRISPR-Cas9双sgRNA方法敲入组合的双向启动子Pj23119-PkasO,显著增强红霉素生物合成基因eryBIV和eryAI的转录水平（基因转录水平分别提高了32和79倍）,激活了红霉素生物合成基因簇。该重组菌株的红霉素产量随之提高了 58.3%。CRISPRi技术干扰基因表达。选择aceA和sdhA作为靶点,利用定点突变的dCas9构建的CRISPRi技术抑制靶基因的表达,结合温度调控sdhA的抑制强度,使得红霉素产量进一步增加了15.1%。应用CRISPR-Cas9在红色糖多孢菌中重构生物合成基因簇。利用双sgRNA靶向敲除红霉素工业高产菌Ab（HP）中的红霉素合成基因簇（ery BGC,49491 bp）,得到AbΔery菌株。该菌株具有提供甲基丙二酰辅酶A和丙酰辅酶A的潜力,有助于将红色糖多孢菌改造为以甲基丙二酰辅酶A和丙酰辅酶A为前体的其他次级代谢产物异源合成的底盘细胞。本研究构建了有效的红色糖多孢菌的CRISPR-Cas9基因编辑技术。基于温敏性质粒的基因编辑框架,有利于多个基因重复多次的遗传操作;基于CRISPR-Cas9的基因组编辑系统,利用双sgRNA靶向、插入双向强启动子等策略,成功通过红色糖多孢菌的基因编辑和优化改造,提高了红霉素的产量。利用CRISPR-Cas9系统敲除红霉素生物合成基因簇,构建的底盘菌株,具有应用于异源合成甲基丙二酰辅酶A和丙酰辅酶A等为前体的重要次级代谢产物的潜力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略表
• 第1章 绪论
•   1.1 CRISPR-Cas分类
•   1.2 CRISPR-Cas9系统组成元件
•   1.3 CRISPR-Cas9作用机制
•   1.4 CRISPR-Cas9系统的应用
•     1.4.1 CRISPR-Cas9在疾病相关研究中的应用
•     1.4.2 CRISPR-Cas9在合成生物中的应用
•     1.4.3 CRISPR-Cas9技术应用的拓展
•   1.5 放线菌中应用CRISPR-Cas9研究现状
•     1.5.1 放线菌中生物合成基因簇是基因编辑靶标
•     1.5.2 红色糖多孢菌与红霉素生物合成
•   1.6 研究的目的和意义
• 第2章 应用CRISPR-Cas9实现红色糖多孢菌基因编辑
•   2.1 引言
•   2.2 技术路线
•   2.3 实验材料
•     2.3.1 菌种和质粒
•     2.3.2 实验试剂及试剂盒
•     2.3.3 实验仪器
•     2.3.4 培养基及缓冲液
•   2.4 实验方法
•     2.4.1 实验用菌种培养
•     2.4.2 生长曲线与红霉素产量测定
•     2.4.3 红色糖多孢菌基因编辑载体选择
•     2.4.4 表达Flag-egfp融合蛋白的温敏质粒构建
•     2.4.5 sgRNA分析设计及合成
•     2.4.6 Cas9基因编辑质粒构建
•     2.4.7 热激转化及阳性克隆筛选
•     2.4.8 Cas9蛋白表达及纯化
• 1765 Indel载体'>    2.4.9 构建SACE₁765 Indel载体
•     2.4.10 构建双sgRNA靶向无痕敲除indA载体
• 0712载体'>    2.4.11 构建PermE-egfp敲入到SACE₀712载体
•     2.4.12 制备红色糖多孢菌原生质体
•     2.4.13 PEG-3350介导质粒转化原生质体及重组菌筛选
•     2.4.14 测序分析基因组上的敲入序列
•     2.4.15 QPCR分析
•     2.4.16 SDS-PAGE及Western blot分析
•     2.4.17 荧光显微镜检测
•     2.4.18 敲除/敲入效率计算
•   2.5 结果与讨论
•     2.5.1 红霉素检测方法确定
•     2.5.2 温敏复制子pSG5控制Flag-egfp融合表达
•     2.5.3 位点特异性靶向sgRNA确定
• 1765'>    2.5.4 Cas9-sgRNA敲除SACE₁765
•     2.5.5 使用双sgRNA靶向indA提高敲除效率
•     2.5.6 启动子PermE敲入激活下游基因转录
•     2.5.7 分析比较敲除敲入的效率
•   2.6 小结
• 第3章 应用CRISPR-Cas9敲入双向启动子激活红霉素合成基因簇
•   3.1 引言
•   3.2 技术路线
•   3.3 实验材料
•     3.3.1 菌种和质粒
•     3.3.2 实验试剂
•     3.3.3 仪器与耗材和引物
•     3.3.4 培养基及缓冲液
•   3.4 实验方法
•     3.4.1 分析红霉素生物合成基因簇启动子
•     3.4.2 PkasO-Pj23119组合双向启动子检测
•     3.4.3 构建双向启动子敲入载体
•     3.4.4 双向启动子敲入载体转化Ab原生质体
•     3.4.5 筛选Ab::PkasO-Pj23119重组菌
•     3.4.6 双向启动子敲入重组菌QPCR
•     3.4.7 双向启动子敲入后的红色糖多孢菌全蛋白SDS-PAGE
•     3.4.8 双向启动子敲入重组菌发酵产物分析
•   3.5 结果与讨论
•     3.5.1 Pery启动子强度确定
•     3.5.2 sfGFP相mCherry表达
•     3.5.3 组合的双向启动子测序结果
•     3.5.4 双向启动子驱动两侧的荧光蛋白同时表达
•     3.5.5 双向启动子敲入重组菌分析
•     3.5.6 双向启动子敲入重组菌测序结果
•     3.5.7 生物活性法筛选DBPs KI重组菌
•     3.5.8 双向启动子敲入重组菌cDNA定量及转录水平结果
•     3.5.9 双向启动子敲入使红霉素生物合成基因簇转录水平上调
•     3.5.10 红霉素生物合成基因簇激活重组菌全蛋白带型分析
•     3.5.11 红霉素生物合成基因簇激活对次级代谢产物影响分析
•     3.5.12 红霉素生物合成基因簇激活菌株工业培养基摇瓶发酵确定产量
•   3.6 小结
• 第4章 基于CRISPR调控基因表达策略优化代谢流
•   4.1 引言
•   4.2 技术路线
•   4.3 实验材料
•     4.3.1 菌种和质粒
•     4.3.2 实验试剂
•     4.3.3 仪器耗材
•   4.4 实验方法
•     4.4.1 Cas9定点突变为dCas9
•     4.4.2 dCas9温敏载体构建
•     4.4.3 靶向抑制的CRISPRi载体构建
•     4.4.4 CRISPRi质粒转化原生质体
•     4.4.5 靶基因抑制重组菌筛选
•     4.4.6 CRISPRi重组菌QPCR分析
•     4.4.7 CRISPRi重组菌发酵产物分析
•     4.4.8 构建绿光开关载体
•     4.4.9 构建CRISPRa载体
•   4.5 结果与讨论
•     4.5.1 pKE-dCas9-sgRNA质粒验证
•     4.5.2 CRISPRi质粒验证
•     4.5.3 CRISPRi质粒sgRNA测序
•     4.5.4 抑制aceA,sdhA
•     4.5.5 靶向抑制效果比较
•     4.5.6 过表达前体供应的酶菌株确定
•     4.5.7 CRISPRi以及过表达丙酰-CoA羧化酶对产量影响分析
•     4.5.8 绿光调控红色糖多孢菌基因表达
•     4.5.9 CRISPRa质粒测序结果及后期应用可行性分析
•   4.6 小结
• 第5章 应用CRISPR-Cas9技术重构次级代谢途径
•   5.1 引言
•   5.2 技术路线
•   5.3 实验材料
•     5.3.1 菌种和质粒
•     5.3.2 实验试剂
•     5.3.3 仪器耗材
•   5.4 实验方法
•     5.4.1 ery BGC的靶向sgRNA选择
•     5.4.2 ery BGC敲除载体构建
•     5.4.3 敲除ery BGC质粒转化原生质体
•     5.4.4 筛选AbΔery重组菌
•     5.4.5 AbΔery红霉素生物活性分析
•     5.4.6 构建次级代谢途径重构的外源基因表达菌株
•     5.4.7 次级代谢途径重构菌的外源基因QPCR分析
•     5.4.8 HPLC检测发酵产物
•   5.5 结果与讨论
•     5.5.1 红霉素生物合成基因簇靶向sgRNA确定
•     5.5.2 敲除红霉素生物合成基因簇的载体验证
•     5.5.3 敲除红霉素生物合成基因簇载体分析
•     5.5.4 Ab△ery单克隆筛选
•     5.5.5 Ab△ery测序确定红霉素生物合成基因簇敲除成功
•     5.5.6 敲除ery BGC使红霉素合成能力丧失
•     5.5.7 次级代谢途径重构
•   5.6 小结
• 第6章 总结与展望
•   6.1 总结
•   6.2 展望
•   6.3 创新点
• 参考文献
• 致谢
• 附录1 博士期间已发表论文
• 附录2 质粒序列
• 附录3 靶点基因编辑后测序

文章来源

类型: 博士论文

作者: 刘永

导师: 叶邦策

关键词: 红色糖多孢菌,基因编辑,激活

来源: 华东理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 华东理工大学

分类号: Q78

DOI: 10.27148/d.cnki.ghagu.2019.000016

总页数: 172

文件大小: 22740k

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