基于MDCK细胞悬浮培养扩增H9N2流感病毒的维持培养基开发及应用

论文摘要

禽流感大爆发严重威胁养殖业和人类健康,并给社会带来巨大的经济损失,而接种禽流感疫苗是目前主要的预防措施。无血清单细胞悬浮培养因其易于放大、工艺稳定、过程可控等优势,正成为流感疫苗生产的主流技术。面对禽流感疫苗市场供不应求的现状,如何应用无血清单细胞悬浮培养技术提高禽流感病毒产量的研究工作尤为重要。其中,无血清培养基是影响流感病毒生产最关键的因素之一。但当下无血清培养基多依赖国外进口,其价格昂贵、配方保密、不利于过程优化。此外,病毒生产特性不同于细胞生长,而在研究或工业生产中,病毒生产阶段所用维持培养基大多与细胞生长培养基是同一种,这种营养组分的不平衡限制了流感病毒的高效扩增。因此,迫切需要针对病毒生产阶段开发适于流感病毒生产的维持培养基。本文以MDCK细胞和H9N2禽流感病毒为研究对象,首先基于现有的MDCK细胞悬浮培养工艺,连续运用Simplex Lattice、Placektt-Burman和中心组合实验设计三种统计学方法,开发了一种支持H9N2流感病毒在MDCK悬浮细胞中高效扩增的Opt-MM培养基。接着,在摇瓶体系中对稀释接毒工艺进行优化,优化后最优稀释比例为1:1;在2L生物反应器中采用该工艺验证Opt-MM培养基,最高病毒滴度达到214.55 HAU/1O0μl,单细胞产毒率达到51 888.11 virions/cell,与原细胞生长培养基（XP培养基）相比分别提高了 1.22倍和1.26倍。然后进一步研究了该高产过程下的细胞代谢特性,与XP培养基相比,该培养基主要增强了细胞中的糖酵解,提高了Ser、Arg、Val、Ile、Leu、His、Cys、Phe、Lys、Met、His、Tyr、Thr和Gly等氨基酸的比消耗速率以及降低了Ala的比生成速率。最后,该维持培养基的效果除了在不同培养体系中得到验证,还在不同胰酶、毒株及细胞传代等方面进行了相应的验证。通过本文研究,开发了适于流感病毒高效扩增的维持培养基,为禽流感疫苗工业化生产奠定基础;研究了高产过程的细胞代谢特性,为其他细胞系的病毒疫苗培养基开发提供指导。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
•   1.1 禽流感及禽流感疫苗
•     1.1.1 禽流感
•     1.1.2 禽流感病毒
•     1.1.3 禽流感疫苗
•   1.2 禽流感疫苗动物细胞培养工艺
•     1.2.1 动物细胞培养技术的发展
•     1.2.2 MDCK细胞及其生产流感疫苗的方式
•     1.2.3 MDCK细胞无血清培养基的研究进展
•   1.3 流感病毒维持培养基的开发
•     1.3.1 细胞生长培养基与维持培养基
•     1.3.2 影响流感病毒生产的重要添加物
•     1.3.3 无血清培养基的开发方法
•   1.4 本文的研究内容、目的及意义
• 第2章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 细胞株
•     2.1.2 流感病毒株
•     2.1.3 培养基
•     2.1.4 实验材料及仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 贴壁MDCK细胞复苏与传代培养
•     2.2.2 悬浮MDCK细胞复苏与传代培养
•     2.2.3 病毒感染
•   2.3 分析方法
•     2.3.1 细胞计数
•     2.3.2 流感病毒HA滴度的测定
• 50的测定'>    2.3.3 流感病毒TCID₅₀的测定
•     2.3.4 细胞代谢物浓度的测定
•   2.4 数据处理
•     2.4.1 细胞比生长速率的计算
•     2.4.2 MOI的计算
•     2.4.3 单细胞产毒率的计算
•     2.4.4 代谢物比消耗或比生成速率的计算
•     2.4.5 统计学分析
• 第3章 维持培养基的开发与优化
•   3.1 前言
•   3.2 实验方案
•   3.3 结果与讨论
•     3.3.1 Simplex Lattice实验设计筛选维持培养基基本组成
•     3.3.2 Placektt-Burman实验设计筛选促进流感病毒生产的显著添加物
•     3.3.3 中心组合设计优化促进病毒生产的显著添加物浓度
•   3.4 本章小结
• 第4章 维持培养基在生物反应器中的验证及细胞代谢研究
•   4.1 引言
•   4.2 实验方案
•   4.3 结果与讨论
•     4.3.1 接毒稀释流加工艺优化
•     4.3.2 2L生物反应器验证
•     4.3.3 细胞代谢特性研究
•   4.4 本章小结
• 第5章 维持培养基的应用初探
•   5.1 前言
•   5.2 实验方案
•   5.3 结果与讨论
•     5.3.1 维持培养基在不同种类胰酶条件下的应用
•     5.3.2 维持培养基在不同种类毒株条件下的应用
•     5.3.3 维持培养基在MDCK细胞传代方面的应用
•   5.4 本章小结
• 第6章 全文总结与展望
•   6.1 全文总结
•   6.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间撰写的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 谢盼

导师: 谭文松

关键词: 细胞,流感病毒,维持培养基,悬浮培养,细胞代谢

来源: 华东理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技,医药卫生科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学,基础医学

单位: 华东理工大学

分类号: R373.13;S852.65

总页数: 72

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