A型塞内卡病毒衣壳蛋白的原核表达及其病毒样颗粒的体外组装与效果评价

论文摘要

A型塞内卡病毒（Seneca virus A,SVA）是近年来发现的引起猪水疱性疾病的新病原体,属于小RNA病毒科塞内卡病毒属,典型病变特征为猪鼻镜、蹄冠部出现水泡和溃烂等,仔猪死亡率达30%70%。自2007年发现该病以来,多个不同国家和地区报道有相关感染病例;2015年我国出现小范围流行。由于SVA毒力基因表型不断发生变异,意味着该病可能存在大范围流行的潜在风险,因此迫切需要建立与研发针对该病的防控策略与疫苗产品。病毒样颗粒作为一种安全高效的新型疫苗,其结构与天然病毒粒子衣壳相似,不含核酸无反毒风险,密集排列的B/T细胞抗原表位赋予其良好的免疫原性,作为一种候选疫苗在人类和动物疫苗领域已得到广泛研究。本研究构建了SVA衣壳蛋白的重组表达质粒,并以大肠杆菌为表达系统对其进行原核表达,对获得的目标蛋白进行体外组装,最终形成完整的病毒样颗粒,为SVA新型疫苗的研究奠定基础。1.pSMA-VP0、pSMK-VP1与pSMC-VP3重组表达载体构建及其小剂量诱导表达:以重组质粒p-UC57SVAV0、p-UC57SVAV1、p-UC57SVAV3为模板扩增SVA目的基因VP0、VP1、VP3,将其分别克隆至含多聚组氨酸（His）和和小泛素样蛋白（SUMO）的原核表达载体pSMK、pSMA、pSMC中。测序后的阳性质粒分别命名为pSMA-VP0、p SMK-VP1、pSMC-VP3,之后将其共转化于BL21（DE3）中,通过小剂量诱导表达方法筛选出阳性表达菌。2.重组蛋白His-SUMO-VP0、His-SUMO-VP1、His-SUMO-VP3表达条件优化与蛋白纯化:为提高蛋白表达效率对其诱导表达条件进行优化,包括诱导温度、诱导剂（I PTG）浓度、诱导前菌的OD600nm值、诱导时间,利用最佳表达条件大量表达后采用镍柱亲和层析纯化法获得高纯度的目标蛋白,并以Western-blotting检测其反应原性。由SDS-PAGE结果显示表达菌OD600nm值达1.1时加入0.4 mmol/L IPTG,20℃下诱导14 h效果最好,且免疫印迹结果可知重组蛋白His-SUMO-VP0、His-SUMO-VP1和Hi s-SUMO-VP3反应原性良好。3.SVA-VLPs组装与效果评价:利用SUMO蛋白酶切除融合蛋白N端的His-SU MO标签,获得天然构象的VP0、VP1、VP3可在适宜的体外环境下自行组装。本实验在已有的研究基础上探索了不同浓度硫酸铵溶液对SAV VLPs体外组装效率的影响,得出适宜浓度的硫酸铵缓冲液对SVA VLPs组装有明显促进作用。由纳米粒度仪（DLS）、蔗糖密度梯度离心实验（SDGC）以及透射电镜（TEM）等数据显示三个蛋白单体在400 mmol/L硫酸铵缓冲液中可成功组装为SVA-VLPs,且直径大小为30 nm左右,电镜下呈轮廓清晰、圆形空心颗粒,Western-blotting结果证明该粒子具有良好反应原性。综上所述,本研究以带His标签和SUMO标签的pSMK、pSMA以及pSMC为载体构建了pSMA-VP0、pSMK-VP1、pSMC-VP3的重组质粒,通过原核表达系统成功表达了可溶性的SVA三种结构蛋白VP0、VP1、VP3,并对其表达条件进行优化,将获得天然构象的VP0、VP1、VP3蛋白在体外组装为VLPs,该研究将为SVA病毒样颗粒疫苗的制备奠定一定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
•   1.1 A型塞内卡病毒的研究进展
•     1.1.1 分子生物学特征
•     1.1.2 流行病学
•     1.1.3 临床症状与病理特征
•     1.1.4 诊断和预防
•     1.1.5 感染后宿主细胞反应
•     1.1.6 感染宿主机制
•     1.1.7 SVA疫苗研究进展
•   1.2 病毒样颗粒研究进展
•     1.2.1 病毒样颗粒概述
•     1.2.2 病毒样颗粒的分类
•     1.2.3 病毒样颗粒的表达系统
•     1.2.4 病毒样颗粒的纯化
•     1.2.5 病毒样颗粒的鉴定
•   1.3 研究的目的及意义
• 第二章 A型塞内卡病毒原核重组表达载体的构建
•   2.1 材料
•     2.1.1 质粒 菌种 表达载体和抗体
•     2.1.2 主要生物学试剂
•     2.1.3 仪器和设备
•   2.2 方法
•     2.2.1 引物设计与合成
•     2.2.2 SVA衣壳蛋白重组表达载体的构建
•   2.3 结果
•     2.3.1 重组质粒pSMA-VP0、pSMK-VP1、pSMC-VP3 的构建
•     2.3.2 重组质粒pSMA-VP0、pSMK-VP1、pSMC-VP3 小剂量表达与蛋白纯化
•   2.4 讨论
• 第三章 SVA衣壳蛋白表达条件优化
•   3.1 实验仪器
•   3.2 方法
•     3.2.1 衣壳蛋白VP0、VP1、VP3 表达条件的优化
•     3.2.2 衣壳蛋白的表达纯化
•     3.2.3 免疫印迹分析
•   3.3 结果
•     3.3.1 衣壳蛋白VP0、VP1、VP3 表达条件的优化
•     3.3.2 VP0、VP1、VP3 蛋白纯化
•     3.3.3 免疫印迹分析
•   3.4 讨论
• 第四章 A型塞内卡病毒样颗粒的体外组装与效果评价
•   4.1 实验材料与设备
•   4.2 方法
•     4.2.1 SVA-VLPs的制备
•     4.2.2 SVA-VLPs纯化与鉴定
•     4.2.3 SVA-VLPs效果评价
•   4.3 结果
•     4.3.1 His-SUMO标签切除
•     4.3.2 SVA-VLPs组装鉴定与效果评价
•   4.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 莫亚霞

导师: 姚学萍,孙世琪

关键词: 型塞内卡病毒,衣壳蛋白,原核表达系统,病毒样颗粒

来源: 四川农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 四川农业大学

分类号: S852.65

DOI: 10.27345/d.cnki.gsnyu.2019.000781

总页数: 65

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