E3泛素连接酶RNF114通过泛素化降解NS4B蛋白抑制猪瘟病毒复制

论文摘要

猪瘟是一种猪的烈性传染病,其病原体猪瘟病毒（CSFV）属于黄病毒科瘟病毒属成员。蛋白质的泛素化修饰是一种重要而广泛的修饰过程,参与细胞内许多生理过程。宿主利用泛素化修饰抵抗病毒的感染,而病毒利用泛素化修饰介导免疫逃逸。目前,文献相继报道,蛋白质的泛素化修饰参与黄病毒科病毒的生命周期。前期,本实验室将表达萤火虫荧光素酶的报告病毒（rCSFV-Fluc）感染过表达猪源干扰素刺激基因（ISGs）的PK-15细胞系,筛选到E3泛素连接酶RNF114（ZNF313）为一种潜在的抗CSFV宿主分子,但其抗病毒机制尚不清楚。本研究旨在证实猪源RNF114（pRNF114）的抗CSFV活性,并解析其抑制CSFV复制的分子机制。我们检测了CSFV感染过程中pRNF114的表达情况,结果表明,在CSFV-SM株感染猪的外周血单个核细胞（体内）以及CSFV感染的PK-15、肺泡巨噬细胞和外周血单个核细胞（体外）中,RNF114的mRNA水平随着CSFV感染时间、感染剂量的增加而上调,说明pRNF114参与调控CSFV的复制。在pRNF114抗病毒功能方面:我们将不同剂量（MOI=0.01和0.1）的rCSFV-Fluc或CSFV-SM株感染过表达pRNF114的PK-15细胞系（PK-pRNF14）,感染24和48 h后,从荧光素酶活性、病毒滴度和基因组拷贝数3个方面评价CSFV的复制水平,结果表明,过表达pRNF114抑制CSFV的复制;相反,用CSFV感染敲除RNF114的PK-15细胞系（PK-RNF14-KO）,在感染后24和48 h检测CSFV复制水平,结果表明,敲除内源性RNF114促进CSFV复制。过表达及敲除试验均证实,pRNF114是一种抗CSFV宿主分子。在pRNF114抗CSFV分子机制方面:首先,我们构建了pRNF114（C64/67A）突变体,并用体外泛素化试验证实,pRNF114（C64/67A）缺失E3泛素连接酶活性;CSFV感染PK-pRNF114（C64/67A）细胞系后,结果表明,pRNF114（C64/67A）不能抑制CSFV复制,说明pRNF114抑制CSFV复制依赖其E3泛素连接酶活性;其次,通过免疫共沉淀（Co-IP）筛选到pRNF114与CSFV NS4B蛋白存在直接的相互作用,且证实pRNF114通过蛋白酶体途径降解NS4B蛋白;最后,我们构建了不同位点赖氨酸突变的泛素突变体,证实pRNF114催化NS4B蛋白发生K27连接的聚泛素化修饰。综上所述,我们证实,pRNF114是一种抗CSFV宿主分子;并阐明pRNF114抗CSFV复制的机制:pRNF114介导NS4B蛋白发生K27连接的聚泛素化修饰,促进NS4B蛋白经蛋白酶体途径降解,进而发挥抗CSFV作用。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 英文缩略表
• 第一章 引言
•   1.1 猪瘟及猪瘟病毒
•     1.1.1 猪瘟
•     1.1.2 猪瘟病毒
•     1.1.3 猪瘟病毒NS4B蛋白
•   1.2 E3泛素连接酶
•     1.2.1 RING E3 泛素连接酶
•     1.2.2 RING E3 泛素连接酶抗病毒作用
•   1.3 猪瘟病毒及其它黄病毒科成员与E3泛素连接酶的相互关系
•   1.4 研究目的和意义
• 第二章 E3 泛素连接酶PRNF114 的抗猪瘟病毒活性研究
•   2.1 材料和方法
•     2.1.1 细胞和毒株
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要仪器设备
•     2.1.4 动物感染试验
•     2.1.5 外周血单个核细胞的分离
•     2.1.6 RNA提取及反转录
•     2.1.7 荧光定量RT-qPCR
•     2.1.8 质粒的构建及细胞转染
•     2.1.9 稳定表达pRNF114和pRNF114（C64/67A）的PK-15 细胞系构建
•     2.1.10 敲除RNF114的PK-15 细胞系构建
•     2.1.11 细胞活力测定
•     2.1.12 病毒滴度测定
•     2.1.13 免疫共沉淀试验
•     2.1.14 GST蛋白纯化
•     2.1.15 GST pulldown试验
•     2.1.16 体外泛素化试验
•     2.1.17 Western blotting检测
•     2.1.18 激光共聚焦试验
•     2.1.19 统计学分析
•   2.2 结果
•     2.2.1 CSFV感染诱导pRNF114 表达上调
•     2.2.2 过表达pRNF114 抑制CSFV复制
•     2.2.3 敲除内源性RNF114 促进CSFV复制
•     2.2.5 pRNF114 抑制CSFV复制依赖其E3 泛素连接酶活性
•     2.2.6 pRNF114 与CSFV NS4B蛋白相互作用
•     2.2.7 pRNF114（69-228）结构域与NS4B（180-347）结构域相互作用
•     2.2.8 pRNF114 通过蛋白酶体途径降解NS4B蛋白
•     2.2.9 pRNF114 泛素化NS4B蛋白
•     2.2.10 pRNF114 催化NS4B蛋白发生K27 连接的聚泛素化修饰
•   2.3 讨论
• 第三章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张越秀

导师: 仇华吉

关键词: 猪瘟病毒,泛素连接酶,抗病毒活性

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院

分类号: S852.651

总页数: 52

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