介孔氧化硅固定化脂肪酶及其非水相催化应用

论文摘要

脂肪酶（EC 3.1.1.3）,在水相中能够催化脂类物质水解,在非水相中催化酯合成、酯交换等反应,具有十分重要的工业应用价值。但是在非水相催化中,脂肪酶通常表现出比远低于水相体系催化活性,限制了其工业化应用。固定化酶技术可以很好的解决上述问题,显著改善脂肪酶分子的非水相催化活性和稳定性。介孔氧化硅siliceous mesocellular foams（MCFs）由于具有较大的孔径、孔体积和比表面积,且易于表面修饰,是一种十分优异的固定化酶载体。本研究以不同功能基团修饰MCFs为载体,以根霉来源脂肪酶r27RCL和南极假丝酵母来源脂肪酶CALB为模式酶,采用不同方法固定化脂肪酶,研究对脂肪酶分子非水相催化活性和稳定性的影响。1、基于脂肪酶具有“界面激活”特性,采用疏水性MCFs固定化脂肪酶,研究了载体表面疏水程度对固定化脂肪酶非水相催化活性和稳定性的影响。采用不同碳链长度的烷基硅烷修饰MCFs,并以此为载体固定化脂肪酶,固定化酶的负载量、非水相催化活性、有机相热稳定性、有机溶剂耐受性等均随着载体表面疏水程度增强而增加。其中十八烷基硅烷修饰MCFs固定化酶（MCFs-C18-r27RCL和MCFs-C18-CALB）表现出最高酯合成活性,合成辛酸乙酯活性分别是游离酶的15和20倍。固定化酶用于拆分苯乙醇,显示出良好的催化效果,其中MCFs-C18-r27RCL显著改善了对映体拆分性能（MCFs-C18-r27RCL,E≥400,eep≥99%;游离酶,E=4,eep=56%）。2、基于传统偶联剂戊二醛（G）固定化酶易于造成酶活性损失较大,选择以醛基阿拉伯胶（GA）为偶联剂,氨丙基修饰MCFs（MCFs-NH2）为载体,通过共价结合方式固定化脂肪酶,研究对固定化脂肪酶非水相催化活性和稳定性的影响。在最适条件下,醛基阿拉伯胶为偶联剂固定化酶（MCFs-NH2-GA-r27RCL和MCFs-NH2-GA-CALB）合成辛酸乙酯活性分别是戊二醛为偶联剂固定化酶（MCFs-NH2-G-r27RCL和MCFs-NH2-G-CALB）的1.3倍和1.2倍。此外,与戊二醛为偶联剂固定化脂肪酶相比,醛基阿拉伯胶为偶联剂固定化酶具有更高的有机相热稳定性和重复使用稳定性。例如,在70℃下孵育12 h MCFs-NH2-GA-r27RCL仍能保留45%的活性,MCFs-NH2-G-r27RCL则保留42%的酶活性。MCFs-NH2-GA-CALB能保留60%的相对活性,而MCFs-NH2-G-CALB则保留56%的相对活性。3、基于单一吸附固定化酶易于造成酶分子脱落等问题,采用疏水吸附和共价结合共同固定化脂肪酶,研究对脂肪酶分子非水相催化活性和稳定性的影响。以环氧基和辛基共同修饰的MCFs为载体（MCFs-epoxy-C8）通过共价结合和疏水吸附共同固定化脂肪酶,与采用单一固定化酶方式相比,MCFs-epoxy-C8固定化脂肪酶表现出较高的非水相催化活性、有机相热稳定性、甲醇耐受性和重复使用稳定性。例如,在70℃正庚烷中孵育12 h,MCFs-epoxy-C8-r27RCL仍能保留42%的活性,而辛基修饰的MCFs吸附固定化r27RCL（MCFs-C8-r27RCL）则保留40%的活性。MCFs-epoxy-C8-CALB能保留43%的活性,而辛基修饰的MCFs吸附固定化CALB（MCFs-C8-CALB）则保留40%的活性。在30%甲醇溶液中孵育2 h,MCFs-epoxy-C8-r27RCL保留34%的活性,而MCFs-C8-r27RCL保留20%的活性。在30%甲醇溶液中孵育96 h,MCFs-epoxy-C8-CALB保留98%的活性,MCFs-C8-CALB则保留81%的活性。4、基于传统交联剂戊二醛固定化酶易于造成酶活性损失较大,采用生物大分子作为交联剂固定化脂肪酶,研究对脂肪酶分子非水相催化活性和稳定性的影响。通过高碘酸钠介导的氧化反应制备了醛基阿拉伯胶（GA）和醛基海藻酸钠（SA）溶液,其醛基浓度分别为83 mM和20 mM。以此为交联剂在辛基修饰MCFs（MCFs-C8）孔道内交联酶的聚集体。两种生物大分子固定化脂肪酶均显示出较好的非水相催化活性、有机相热稳定性、甲醇耐受性和重复使用稳定性。例如,醛基阿拉伯胶在辛基修饰MCFs孔道内交联脂肪酶r27RCL聚集体（GA-CLEAs@MCFs-C8-r27RCL）合成辛酸乙酯活性为游离酶的12.2倍,在70℃正庚烷中孵育12 h仍能保留48%的活性,在30%甲醇溶液中孵育2 h保留37%的活性。而戊二醛固定化r27RCL（G-CLEAs@MCFs-C8-r27RCL）活性为游离酶的8.4倍,在70℃正庚烷中孵育12 h保留43%的活性,在30%甲醇溶液中孵育2 h保留35%的活性。醛基阿拉伯胶在辛基修饰MCFs孔道内交联脂肪酶CALB聚集体（GA-CLEAs@MCFs-C8-CALB）合成辛酸乙酯活性为游离酶的20倍,在70℃正庚烷中孵育12 h仍能保留57%的活性,在30%甲醇溶液中孵育96 h保留99%的活性。而戊二醛固定化CALB（G-CLEAs@MCFs-C8-CALB）活性为游离酶的13倍,在70℃正庚烷中孵育12 h保留42%的活性,在30%甲醇溶液中孵育96 h保留97%的活性。5、根据选用两种脂肪酶的催化特性,研究了固定化脂肪酶非水相催化应用性能。基于根霉来源脂肪酶r27RCL具有sn-1,3位置识别能力,以三棕榈酸甘油酯（PPP）和油酸为原料,采用不同固定化r27RCL合成1,3-二油酸-2-棕榈酸三甘酯（OPO）。在较优条件下（固定化酶添加量为30 mg,水含量为4%（油重）,三棕榈酸甘油酯与油酸摩尔比为1:6,反应温度为50℃,反应时间为48 h）,GA-CLEAs@MCFs-C8-r27RCL催化合成OPO获得最高油酸占有率（37%）,重复使用5次后仍能保留较高的转化率。基于CALB具有较好的非水相催化能力,以大豆油和甲醇为原料,采用不同固定化CALB合成生物柴油。在较优条件下（固定化酶添加量为30 mg,水含量为12%（油重）,油醇摩尔比为1:6,每6 h添加一次甲醇,反应温度为40℃,反应时间为24 h）,GA-CLEAs@MCFs-C8-CALB催化合成生物柴油获得最高的脂肪酸甲酯的转化率（91%）,重复使用5次后仍能保留较高的转化率。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 固定化酶概述
•   1.2 介孔氧化硅固定化酶
•     1.2.1 介孔氧化硅的介绍
•     1.2.2 介孔氧化硅的功能性修饰
•     1.2.3 固定化酶的方法
•     1.2.4 影响固定化酶活性和稳定性的因素
•   1.3 非水相催化
•     1.3.1 非水相催化体系
•     1.3.2 提高酶在非水相催化活性和稳定性的方法
•   1.4 脂肪酶及其在非水相酶催化的应用
•     1.4.1 脂肪酶简介
•     1.4.2 酶法合成生物柴油
•     1.4.3 酶法合成人乳脂替代品
•   1.5 本课题的立题背景与意义
•   1.6 本课题的主要研究内容
• 第二章 不同烷基化MCFs固定化脂肪酶改善非水相催化性能
•   2.1 引言
•   2.2 材料与方法
•     2.2.1 主要材料与仪器
•     2.2.2 MCFs的合成
•     2.2.3 烷基修饰MCFs的合成
•     2.2.4 制备固定化酶
•     2.2.5 固定化脂肪酶的活性测定
•     2.2.6 固定化酶的稳定性
•     2.2.7 固定化酶拆分苯乙醇
•     2.2.8 重复使用稳定性
•     2.2.9 不同功能性修饰介孔氧化硅的表征
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 不同功能性修饰介孔氧化硅的表征
•     2.3.2 固定化酶的活性
•     2.3.3 固定化酶的热稳定性
•     2.3.4 固定化酶的有机溶剂耐受性
•     2.3.5 固定化酶拆分苯乙醇
•     2.3.6 固定化酶的重复使用稳定性
•   2.4 本章小结
• 第三章 醛基阿拉伯胶-氨丙基修饰MCFs共价结合固定化脂肪酶
•   3.1 引言
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 实验材料
•     3.2.2 MCFs的合成
•     3.2.3 氨丙基修饰MCFs的合成
•     3.2.4 制备醛基阿拉伯胶
•     3.2.5 制备固定化酶
•     3.2.6 固定化脂肪酶的活性测定
•     3.2.7 固定化脂肪酶动力学参数测定
•     3.2.8 固定化脂肪酶稳定性
•     3.2.9 不同功能性修饰介孔氧化硅的表征
•   3.3 结果与讨论
•     3.3.1 不同功能性修饰介孔氧化硅的表征
•     3.3.2 制备固定化酶条件优化
•     3.3.3 固定化酶动力学参数
•     3.3.4 固定化酶有机相热稳定性
•     3.3.5 固定化酶甲醇耐受性
•     3.3.6 固定化酶重复使用稳定性
•   3.4 本章小结
• 第四章 环氧基-辛基修饰MCFs双重固定化脂肪酶
•   4.1 引言
•   4.2 材料与方法
•     4.2.1 实验材料
•     4.2.2 MCFs的合成
•     4.2.3 功能化修饰MCFs的合成
•     4.2.4 不同功能化修饰MCFs表面环氧基含量测定方法
•     4.2.5 制备固定化酶
•     4.2.6 固定化脂肪酶的活性测定
•     4.2.7 固定化脂肪酶的稳定性
•     4.2.8 不同功能化修饰介孔氧化硅的表征
•   4.3 结果与讨论
•     4.3.1 不同功能化修饰介孔氧化硅的表征
•     4.3.2 固定化脂肪酶酯合成活性
•     4.3.3 固定化脂肪酶有机相热稳定性
•     4.3.4 固定化酶甲醇耐受性
•     4.3.5 固定化酶重复使用稳定性
•   4.4 本章小结
• 第五章 醛基生物大分子交联酶的聚集体
•   5.1 引言
•   5.2 材料与方法
•     5.2.1 实验材料
•     5.2.2 MCFs的合成
•     5.2.3 辛基修饰MCFs的合成
•     5.2.4 制备醛基生物大分子
•     5.2.5 制备固定化酶
•     5.2.6 固定化脂肪酶的活性测定
•     5.2.7 固定化脂肪酶动力学参数测定
•     5.2.8 固定化脂肪酶稳定性
•     5.2.9 固定化酶的表征
•   5.3 结果与讨论
•     5.3.1 固定化酶的表征
•     5.3.2 制备生物大分子交联剂
•     5.3.3 交联酶的聚集体制备条件优化
•     5.3.4 固定化酶动力学参数
•     5.3.5 固定化酶有机相热稳定性
•     5.3.6 固定化酶甲醇耐受性
•     5.3.7 固定化酶重复使用稳定性
•   5.4 本章小结
• 第六章 固定化脂肪酶非水相催化应用研究
•   6.1 引言
•   6.2 材料与方法
•     6.2.1 实验材料
•     6.2.2 固定化脂肪酶的活性测定
•     6.2.3 固定化脂肪酶合成OPO
•     6.2.4 固定化酶合成生物柴油
•     6.2.5 固定化脂肪酶重复使用稳定性
•   6.3 结果与讨论
•     6.3.1 固定化酶合成OPO
•     6.3.2 固定化酶合成生物柴油
•   6.4 本章小结
• 论文主要结论
• 展望
• 论文创新点
• 致谢
• 参考文献
• 作者攻读博士期间发表论文清单

文章来源

类型: 博士论文

作者: 靳文斌

导师: 喻晓蔚

关键词: 脂肪酶,介孔氧化硅,非水相催化,醛基阿拉伯胶,醛基海藻酸钠

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 江南大学

分类号: Q814.2

DOI: 10.27169/d.cnki.gwqgu.2019.000070

总页数: 98

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