食品体系中乳杆菌的压力应答机制及其与酵母的群体相互作用

论文摘要

食品工业是关系国计民生的生命产业,是一个国家经济发展水平和人民生活质量的重要标志。食品安全是社会关注的焦点,各类食品安全问题中微生物污染问题居于首位。传统食品微生物安全问题集中于由致病微生物引起的食物中毒,而由腐败微生物引起的食品腐败变质,同样属于重要的食品微生物安全问题。食品是化学及生物组成复杂的体系,食品中微生物通常是多种属以群体形式存在。微生物在食品中的角色差异及群体作用,使其存在共生、协同或拮抗作用。因此,根据食品体系中化学与微生物组成,了解微生物的行为及其群体相互作用对实现腐败微生物的控制尤为重要。本文针对经微生物检测合格的食品中出现活的但不可培养（VBNC）状态乳杆菌导致食品在货架期内腐败变质的实际事件,基于食品体系中多微生物共存且互相影响的实际情况,同时考虑微生物的特定生长模式,研究食品腐败乳杆菌VBNC状态的形成和特征,从基因功能和转录层面上揭示了乳杆菌的压力应答（VBNC状态形成）机制,并探究食品体系中腐败细菌（乳杆菌）和发酵真菌（酵母）的群体相互作用及其调控机制,针对假丝酵母形成菌丝的典型特性,探究乳杆菌通过影响假丝酵母葡萄糖信号传导通路调控BLP1基因表达而抑制菌丝形成的机制。主要研究内容和结果如下:（1）模拟食品体系及其储藏环境,研究乳杆菌VBNC状态形成条件与特性,并从基因功能和转录层面探究其形成机制。选取典型食品腐败乳杆菌,采用连续传代法和低温储藏法分别进行VBNC状态诱导,第一代时106cells/mL以上活菌进入VBNC状态,105至196天和17至32代后全部活菌处于VBNC状态。VBNC状态乳杆菌菌体缩小,具有与正常状态相似的乳酸、乙酸与双乙酰代谢能力和食品腐败能力。基于乳杆菌VBNC状态的表型特征,对典型乳杆菌进行全基因组学研究,并选取代表VBNC状态形成过程的正常状态、半胁迫状态与VBNC状态进行转录学研究,从基因功能和转录水平上获得乳杆菌VBNC状态形成机制。乳杆菌在食品体系中连续传代或其储藏环境的低温压力条件下,通过启动7个压力应答因子抵抗外界压力,并下调18个转运、7个代谢过程、28个酶活性、4个生物合成等相关基因的表达降低自身需求从而适应环境压力,最终进入VBNC状态。（2）基于乳杆菌与酵母在食品体系中共存的实际情况,探究乳杆菌与酵母的群体相互作用模型。根据乳杆菌和酵母在食品体系中的比例差异及部分酵母的特殊生长模式,探究不同浓度比例乳杆菌和不同生长模式酵母群体相互作用过程中的表型变化,并从基因转录水平上探究其相互作用机制。具有不同生长模式的酿酒酵母与假丝酵母和乳杆菌相互作用模型相似,表型方面,乳杆菌在自身生长不受影响的基础上抑制酵母的生长;分子机制方面,乳杆菌启动lamBDCA群感效应（QS）系统,部分菌体对假丝酵母产生粘附,并释放信号分子对酵母产生刺激,酵母激活压力应答基因,但基础生理活动、细胞周期、减数分裂与配对通路带来的生长与增殖率下降,以及饥饿调整通路、高渗压力生存通路、细胞壁重塑通路与维持细胞壁完整性的WSC1/2/3基因下调导致部分菌体死亡,使酵母菌量下降,同时双方代谢均发生变化。（3）基于假丝酵母形成菌丝的典型特征,从表型和基因通路层面探究乳杆菌对假丝酵母菌丝形成的调控作用。从表型层面探究乳杆菌对假丝酵母菌丝形成的影响,针对菌丝形成关键基因BLP1,研究调控BLP1基因表达的表型和信号传导通路,进而深入探究乳杆菌调控BLP1基因表达并抑制菌丝形成的分子机制。结果表明,乳杆菌启动QS系统增加细胞表面粘附能力,对假丝酵母产生粘附作用,并释放信号因子,刺激假丝酵母葡萄糖阻遏通路中HGT19转运因子表达上调,将葡萄糖转运进入胞内,同时HXK2基因的表达上调,使Hxk2激酶合成增加,将葡萄糖磷酸化为葡萄糖-6-磷酸,GLC7与REG1基因的上调,增强Glc7/Reg1磷酸酶复合体的生成,使其识别葡萄糖-6-磷酸,抑制SNF1基因的表达,导致Snf1激酶无法合成,激活MIG1/2转录抑制因子,同时HCM1转录诱导因子表达下调,BLP1基因表达被抑制,因此阻断菌丝形成。（4）结合乳杆菌压力应答、与酵母的群体相互作用和调控假丝酵母菌丝形成机制进行深入分析,总结其压力应答及与酵母群体互作的内在机制。在（2）中所述QS系统介导的群体作用模式下,由于酿酒酵母和假丝酵母生长模式和自身基因组的差异,与乳杆菌的相互作用的表型和分子机制中也存在部分差异,包括生长抑制率和具体的信号分子、压力应答基因及代谢通路的差异,以及乳杆菌对假丝酵母菌丝形成的调控。群体相互作用刺激乳杆菌启动3-5个压力应答基因并下调氨基酸和脂肪酸代谢,为乳杆菌VBNC状态形成的部分内在诱因,但可能由于缺少剩余部分压力应答基因的启动和代谢、转运等通路的下调作用,未达到VBNC状态形成阈值,乳杆菌保持生长。本论文考察了食品体系中腐败乳杆菌的压力应答（VBNC状态形成）及其与不同生长模式酵母的群体相互作用,获得的分子机制为食品体系中腐败微生物引起的假阴性检测和食品体系中化学和生物组成变化的双重控制提供崭新的思路和科学依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
•   1.1 乳杆菌概述
•   1.2 酵母概述
•     1.2.1 酿酒酵母
•     1.2.2 假丝酵母
•   1.3 细菌的压力应答
•     1.3.1 VBNC状态的形成与特性
•     1.3.2 VBNC状态的形成机制
•   1.4 多微生物相互作用
•     1.4.1 乳杆菌与酿酒酵母的相互作用
•     1.4.2 乳杆菌与假丝酵母的相互作用
•     1.4.3 群感效应
•   1.5 本课题的研究背景、意义和内容
•     1.5.1 研究背景和意义
•     1.5.2 研究内容
• 第二章 乳杆菌VBNC状态的诱导及特性
•   2.1 引言
•   2.2 实验材料与方法
•     2.2.1 实验材料与设备
•     2.2.2 VBNC状态的诱导
•     2.2.3 VBNC状态的鉴定
•     2.2.4 SEM观察菌体形态
•     2.2.5 食品腐败和产酸、双乙酰能力检测
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 乳杆菌VBNC状态的形成
•     2.3.2 VBNC状态乳杆菌的特性
•   2.4 本章小结
• 第三章 乳杆菌VBNC状态的形成机制
•   3.1 引言
•   3.2 实验材料与方法
•     3.2.1 实验材料与设备
•     3.2.2 全基因组测序与组装
•     3.2.3 基因预测与功能分析
•     3.2.4 转录组测序与序列比对
•     3.2.5 基因表达与功能富集分析
•   3.3 结果与讨论
•     3.3.1 全基因组功能谱
•     3.3.2 食品腐败和VBNC状态相关基因
•     3.3.3 乳杆菌不同状态转录谱
•     3.3.4 VBNC状态形成过程中关键基因与通路调控
•   3.4 本章小结
• 第四章 乳杆菌与酿酒酵母的群体相互作用
•   4.1 引言
•   4.2 实验材料与方法
•     4.2.1 实验材料与设备
•     4.2.2 共培养体系与生长测定
•     4.2.3 形态观察
•     4.2.4 转录组测序与序列比对
•     4.2.5 基因表达与功能富集分析
•   4.3 结果与讨论
•     4.3.1 共培养体系中菌体生长情况
•     4.3.2 共培养体系中菌体形态变化
•     4.3.3 共培养体系中乳杆菌转录谱
•     4.3.4 共培养体系中乳杆菌关键基因与通路调控
•     4.3.5 共培养体系中酿酒酵母转录谱
•     4.3.6 共培养体系中酿酒酵母关键基因与通路调控
•     4.3.7 乳杆菌与酿酒酵母群体相互作用机制
•   4.4 本章小结
• 第五章 乳杆菌与假丝酵母的群体相互作用
•   5.1 引言
•   5.2 实验材料与方法
•     5.2.1 实验材料与设备
•     5.2.2 共培养体系与生长测定
•     5.2.3 形态观察
•     5.2.4 转录组测序与序列比对
•     5.2.5 基因表达与功能富集分析
•   5.3 结果与讨论
•     5.3.1 共培养体系中菌体生长情况
•     5.3.2 共培养体系中菌体形态变化
•     5.3.3 共培养体系中乳杆菌转录谱
•     5.3.4 共培养体系中乳杆菌关键基因与通路调控
•     5.3.5 共培养体系中假丝酵母转录谱
•     5.3.6 共培养体系中假丝酵母关键基因与通路调控
•     5.3.7 乳杆菌与假丝酵母群体相互作用机制
•   5.4 本章小结
• 第六章 乳杆菌对假丝酵母菌丝形成的调控机制
•   6.1 引言
•   6.2 实验材料与方法
•     6.2.1 实验材料与设备
•     6.2.2 共培养体系与生长测定
•     6.2.3 形态观察
•     6.2.4 菌株的构建
•     6.2.5 BLP1 基因表达的定性及定量检测
•   6.3 结果与讨论
•     6.3.1 乳杆菌和菌丝态假丝酵母共培养时生长变化
•     6.3.2 乳杆菌对假丝酵母菌丝形成和BLP1 基因表达的影响
•     6.3.3 调控BLP1 基因表达的表型
•     6.3.4 葡萄糖信号传导通路对BLP1 基因表达的调控
•     6.3.5 乳杆菌对假丝酵母菌丝形成的调控机制
•   6.4 本章小结
• 第七章 乳杆菌的压力应答与群体互作的内在机制
•   7.1 引言
•   7.2 实验材料与方法
•     7.2.1 不同共培养体系中乳杆菌转录谱的比对分析
•     7.2.2 酿酒酵母和假丝酵母转录谱的比对分析
•     7.2.3 共培养体系和VBNC状态过程中乳杆菌转录谱的比对分析
•   7.3 结果与讨论
•     7.3.1 乳杆菌与不同生长模式酵母的作用规律
•     7.3.2 群体相互作用对乳杆菌VBNC状态的影响
•     7.3.3 乳杆菌的压力应答与群体互作的内在机制
•   7.4 本章小结
• 结论和展望
•   一、结论
•   二、创新点
•   三、展望
• 参考文献
• 攻读博士学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 附件

文章来源

类型: 博士论文

作者: 刘君彦

导师: 李琳

关键词: 食源性微生物,乳杆菌,酵母,状态,群体相互作用

来源: 华南理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 华南理工大学

基金: 国家“十三五”重点研发计划项目课题(2016YFD0401202-1)

分类号: TS201.3

DOI: 10.27151/d.cnki.ghnlu.2019.000191

总页数: 199

文件大小: 11062K

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