导读:本文包含了结构特异性核酸酶论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:核酸,病毒,特异性,结构,碱基,乙型肝炎,对虾。
结构特异性核酸酶论文文献综述
于昊[1]（2018）在《硫修饰依赖型核酸酶SprMcrA的活性表征及其序列特异性的结构基础》一文中研究指出DNA上有丰富的修饰,绝大多数的修饰位于DNA的碱基上,其中5-甲基胞嘧啶(~(5m)C)的研究最为深入。~(5m)C通过~(5m)C识别结构域(SET-and RING-associated domain,SRA)参与到DNA的复制、基因的调控等方面,与表观遗传学息息相关,这类DNA修饰也称为表观遗传修饰。此外,还有一类特殊的修饰是位于DNA骨架上的磷硫酰化修饰(也称为硫修饰;phosphorothioation,PT),它的结构是硫原子取代DNA磷酸二酯键上非桥接的氧原子。在细菌中,表观遗传修饰更多的是参与到DNA的限制修饰系统(Restriction and modification system)中。DNA限制修饰系统根据限制酶和修饰酶的亚基组成、识别序列、辅助因子、切割方式的不同,又可以分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型。其中,Ⅳ型又称为修饰依赖型限制系统,而通过凝胶电泳可以产生清晰且固定的切割条带的Ⅳ型限制性内切酶也被归类为IIM型核酸酶。前期本研究组在天蓝色链霉菌中发现了一个IV型核酸酶ScoMcrA,只有当DNA被硫修饰或~(5m)C修饰时,才能被其识别和切割,蛋白质晶体结构揭示其同时包含硫修饰结合结构域(SBD)和~(5m)C结合结构域(SRA-like)。同时,ScoMcrA有以下特性:1)只识别并切割对称的靶序列(5′-G_(PS)GCC-3′),无法知道一分子DNA被切几次或在哪一侧切割;2)体外区别硫修饰和非硫修饰DNA特异性较差(反应时间不能超过5分钟);3)切割硫修饰DNA活性较差。这些特点不利于深入研究其酶学活性和切割机理。因此,我们期望找到一个活性更高,靶序列不同或特异性更好的硫修饰依赖型核酸内切酶来实现这些目标。以ScoMcrA的SBD检索数据库发现:包含SBD的同源蛋白按照结构域排列和大小分为叁类:1)head-SBD-SRA-HNH;2)head-SBD-HNH;3)SBD-HNH。来源于始旋链霉菌的SprMcrA属于最小的一类同源蛋白,它仅含326个氨基酸,包含SBD-HNH双结构域。体内限制实验中它对dnd基因簇有>10~3的限制频率,是一个具有生物学活性的磷硫酰化修饰依赖型核酸限制酶。与ScoMcrA相比,SprMcrA的SBD结构域与硫修饰DNA的结合力以及序列特异性方面有较大差异:1)SBD_(Spr)可以结合叁种天然硫修饰核心序列(GGCC、GAAC、GATC)硫修饰DNA,无论修饰发生在上下链(fully)或一条链(hemi);对另外两种天然核心序列(GTTC,CCA)的硫修饰DNA(fully-或hemi-)均没有结合力;而SBD_(Sco)只结合核心序列GGCC;2)SBD_(Spr)对于同一核心序列的硫修饰DNA结合力比SBD_(Sco)要大。此外,与SBD_(Sco)相似,SBD_(Spr)在EMSA实验中只结合R_P构型的磷硫酰化修饰,对于S_P和正常DNA不结合。SprMcrA包含一个非典型的HNH结构域,只有在Mn~(2+)或Co~(2+)存在时具有DNA的切割活性。以人工合成的硫修饰寡聚核苷酸双链或硫修饰质粒DNA作为底物进行体外切割反应时,SprMcrA在约一半的硫修饰位点(G_(PS)AAC)的5′端进行双链DNA切割,切割位点距离磷硫键N11/N12(上链12个核苷酸/下链13个核苷酸)或N13/N14。同时也发现SprMcrA的HNH结构域本身具有DNA序列选择性,已有切点统计HNH的序列特异性为VBN↓VB。SprMcrA对硫和非硫修饰的DNA有>16倍的特异性,切割方向和切割位点固定,可归类于IIM型限制性内切酶。野生型HNH_(Spr)结构域中保守的N被R取代,我们通过定点突变获得SprMcrA_(R284N)突变体蛋白,SprMcrA_(R284N)的切割活性比野生型提高了约30倍,同时也影响到了切割序列的特异性。通过对突变体蛋白与野生型蛋白叁级结构的预测,推测了R284N对切割活性影响的分子机制。为了解释SBD_(Spr)与SBD_(Sco)结合不同硫修饰序列DNA的特异性,本研究解析了SBD_(Spr)与PT-DNA(phosphorothioated DNA)的复合体结构。SBD_(Spr)与PT-DNA的结合力,主要由叁个部分提供:通过疏水范德华力与DNA上硫原子结合的口袋、插入DNA双螺旋大沟中通过氢键作用力与碱基相互作用的碱基识别无规卷曲(‘base contact’loop)、通过静电作用力与DNA磷酸根相互作用的磷酸结合无规卷曲(‘phosphate binding’loop)。通过和SBD_(Sco)的结构进行比较,我们发现,决定SBD底物选择宽泛性的关键因素是‘phosphate binding’loop的电荷性。我们构建了ScoMcrA_(E156R/D157R)突变体蛋白,体内限制实验证实了E156R/D157R双突变可以使其获得体内限制来自大肠杆菌B7A的dnd基因簇(负责G_(PS)AAC/G_(PS)TTC修饰)的能力。综上所述,本研究对磷硫酰化修饰依赖型的IIM型限制性内切酶SprMcrA进行了相关的功能和结构研究。确定了SprMcrA的识别序列和切割位点,加深了对这一类酶功能上的认识,并通过点突变提高了SprMcrA的切割活性,为将SprMcrA发展成为一个针对PT-DNA的工具酶奠定了基础。探讨了SBD结构域对PT-DNA序列识别特异性的分子机理,通过定向改造成功改变了ScoMcrA的序列识别特异性,为核酸结合蛋白序列特异性改造提供了新思路。(本文来源于《上海交通大学》期刊2018-11-01）
李珍华[2]（2015）在《小肠结肠炎耶尔森菌非特异性核酸酶的结构分析及定点突变研究》一文中研究指出小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica subsp.palearctica(Y.e.p))核酸酶是一种非特异性核酸酶,可以降解各种DNA和RNA,无论是单链、双链、线状、环状还是超螺旋形式,而且对核酸的序列没有要求。本实验室前期成功克隆了Y.e.p核酸酶的编码基因nuc,构建了重组表达载体pET24a-nuc,利用IPTG诱导获得重组核酸酶,研究了其酶学性质,发现重组核酸酶不仅具有酶活性高的优点,而且还具有超级耐高温、耐酸碱及耐化学物质等特点。为阐明该酶具有优良性能的原因,本论文通过生物信息学分析和定点突变的方法研究影响Y.e.p非特异性核酸酶酶活和热稳定性的因素,为进一步研究Y.e.p非特异性核酸酶的功能进化奠定基础。主要研究内容和结果如下:(1)用生物学软件全面分析Y.e.p非特异性核酸酶的一级结构、二级结构、结构域和叁级结构,为Y.e.p非特异性核酸酶的定点突变研究提供理论基础。(2)通过对Y.e.p非特异性核酸酶活性位点、盐桥和二硫键定点突变的研究,改变活性位点氨基酸、破坏盐桥和二硫键组成,发现Y.e.p非特异性核酸酶酶活和热稳定性急剧下降,说明活性位点对维持Y.e.p非特异性核酸酶的酶活,盐桥和二硫键对维持Y.e.p非特异性核酸酶的热稳定性具有重要作用。(3)序列比对热不稳定Y.e.e非特异性核酸酶和热稳定Y.e.p非特异性核酸酶,对差异氨基酸进行定点突变,结果发现E202A,I203F,D264E这叁个位点氨基酸的改变能引起酶活及热稳定性变化,由此推测Glu202,Ile203和Asp264可能是影响Y.e.p非特异性核酸酶酶活和热稳定性的关键氨基酸残基。(本文来源于《杭州师范大学》期刊2015-03-01）
刘松柏[3]（2014）在《结构特异性核酸酶FEN1在DNA复制及细胞周期过程中的功能性研究》一文中研究指出DNA复制过程中,校正功能缺失的聚合酶a起始冈崎片段的合成。然而,这种聚合酶合成DNA的准确率比其他DNA复制中的聚合酶6或聚合酶ε要低很多。聚合酶a错配合成需由依赖MSH2的错配修复途径来纠正。通过研究,我们发现哺乳细胞中的FEN1也参与这种修复途径。根据实验结果,MSH2与FEN1相互作用并促进其核酸酶活性去除DNA底物的5’端错义配对,这个过程我们叫做a片段错配纠正(α-segment error editing, AEE)。FEN1内切酶活性和外切酶活性突变体蛋白在体外不能完成a片段错配纠正过程。突变体小鼠具有很强的突变表型,增加了细胞转化及肿瘤发生的几率。通过以上研究我们发现了一种FEN1/MutSa复合体参与的新的聚合酶a合成错配修复机制。FEN1作为一个核酸酶,其活性及位置如果不能得到精密控制,携带有遗传信息的DNA可能会受到任意攻击,细胞周期也会发生紊乱。因此,FEN1在剪切完RNA引物并从PCNA上解离后的去向问题也值得深思。通过前期实验结果,发现FEN1蛋白表达量随着细胞周期阶段发生变化,在S期之后的G2/M期发生泛素化介导的降解(Ubiqutin-proteasome degradation pathway)在这个课题中,我主要利用免疫共沉淀技术及质谱检测方法发现了介导了FEN1降解的泛素化酶激活酶E1:UBE1,结合酶E2:UBE2M以及连接酶E3:PRP19。根据FEN1在细胞周期中程序性翻译后修饰的模型,甲基化的FEN1与PCNA分离时应首先进行去甲基化反应。通过研究,发现FEN 1确实存在去甲基化情况,为了寻找这个FEN1的精氨酸去甲基化酶,我们在FEN1去甲基化过程中利用免疫共沉淀技术发现了潜在的精氨酸去甲基化酶JMJDIB。通过进一步地体外生化活性检测,基本确定JMJD1B蛋白具有特异催化精氨酸甲基化FEN1去甲基化的功能。这意味着我们首次发现了可以对非组蛋白精氨酸甲基化底物去甲基化的酶。(本文来源于《浙江大学》期刊2014-12-01）
潘万龙,方岩,许舸,单雪峰,徐蕾[4]（2012）在《结构特异性核酸酶FEN1对HBV复制的影响》一文中研究指出目的探索宿主因子FEN1对HBV复制过程的影响。方法构建FEN1过表达慢病毒质粒,酶切鉴定并测序,转染293FT细胞,Western blot检测FEN1蛋白表达。将该质粒转染HBV复制稳定细胞系,设立慢病毒包装改造质粒pLenti6/V5-D-TOPO和不转染质粒的细胞作为对照。ELISA检测细胞上清,Southern blot及Real-time PCR检测HBV DNA。结果初筛阳性克隆提取质粒酶切鉴定,于FEN1及线性载体质粒大小处出现明亮单一条带,测序结果表明序列插入正确,Western blot检测FEN1蛋白表达量为对照的2～3倍。FEN1过表达质粒转染HBV复制稳定细胞株,细胞上清ELISA检测HBsAg抗原呈阳性,D(450)值为(1.982±0.032);细胞内提取病毒DNA行Real-time PCR,绝对定量拷贝数为1.18×109,Southern blot检测亦表明HBV复制水平明显上调。结论结构特异性核酸酶FEN1能够明显促进HBV DNA复制,是体内一种重要的病毒复制调控因子。(本文来源于《第叁军医大学学报》期刊2012年19期）
李力[5]（2005）在《对虾白斑杆状病毒非特异性核酸酶基因的功能鉴定及结构蛋白VP31的鉴定》一文中研究指出对虾白斑综合症病毒(White Spot Syndromic Virus,WSSV),是一种严重危害对虾养殖业的主要病原。本论文围绕着病毒致病相关基因开展研究,主要包括两个工作:(1)功能性鉴定WSSV中的非特异性核酸酶基因。研究通过BLAST分析,发现对虾白斑综合症病毒基因组中阅读框WSV191基因编码的蛋白序列中含有核酸酶活性区(enzyme nuclease active site)保守结构域,初步预测该蛋白为核酸酶。为了对该基因的性质有所了解,以及对其所编码蛋白进行(命名为WSV-NSN,WSSV-non specific nuclease)功能鉴定,wsv191全序列基因被克隆至载体pGEX-2T,并在E.coli中进行表达,所得的重组融合蛋白以不溶性的包涵体形式存在。可溶性蛋白通过对变性纯化所得蛋白进行包涵体复性后获得(命名为rWSV-NSN),并采用叁种方法对该蛋白的功能进行鉴定。实验结果表明WSV191具有DNA/RNA非特异性内切酶双重功能。同时通过RACE分析对蛋白的转录情况进行分析,发现该蛋白转录起始点位于预测的翻译起始密码子ATG中的第叁个碱基“G”,因此ORF中下一个ATG确认为该基因真正的翻译起始密码子。Western杂交分析显示其天然蛋白分子量约为37KD。(2)膜蛋白VP31的鉴定。在这部分工作中,我们通过完整病毒的结构蛋白SDS-PAGE电泳结合质谱鉴定分析,初步推测一个分子量为31kDa的蛋白为病毒的膜蛋白。通过氨基酸序列比对确定此蛋白为WSSV基因组中的阅读框WSV340编码的蛋白。WSV340全长783bp,编码261个氨基酸残基,预计分子量为31kDa(命名为VP31)。为了对质谱结果进行进一步的确证,C端420bp片段被克隆并进行原核表达。收集纯化所得的融合蛋白注射小鼠获得特异性多克隆抗体。Western blot分析证明VP31特异的存在于病毒的膜部分。免疫胶体金定位分析也同样证明VP31蛋白分布于病毒的膜部分,因此可以确定VP31蛋白为病毒的一个膜蛋白。同时,细胞结合实验与RGD竞争抑制实验证明VP31能特异地和宿主细胞发生作用,且RGD在细胞结合过程中起关键作用。体内抗体中和实验说明该蛋白在病毒感染宿主细胞过程中起重要作用。(本文来源于《国家海洋局第叁海洋研究所》期刊2005-06-30）
石斌山,余应年[6]（2000）在《结构特异性核酸酶FEN-1的功能和结构》一文中研究指出FEN 1(flapendo/exonuclease)是一种结构特异性核酸酶 ,它能识别特定的DNA分叉结构 ,并切除含有游离 5′端的单链核酸 .在DNA复制过程中 ,FEN 1通过其外切酶、内切酶活力去除了冈崎片段前端RNA引物的最后一个核糖核苷 .在DNA修复中 ,FEN 1以其内切酶活力参与了损伤碱基的修复过程 .FEN 1基因含有两个保守区和一个PCNA结合区 .(本文来源于《生物化学与生物物理进展》期刊2000年02期）
结构特异性核酸酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica subsp.palearctica(Y.e.p))核酸酶是一种非特异性核酸酶,可以降解各种DNA和RNA,无论是单链、双链、线状、环状还是超螺旋形式,而且对核酸的序列没有要求。本实验室前期成功克隆了Y.e.p核酸酶的编码基因nuc,构建了重组表达载体pET24a-nuc,利用IPTG诱导获得重组核酸酶,研究了其酶学性质,发现重组核酸酶不仅具有酶活性高的优点,而且还具有超级耐高温、耐酸碱及耐化学物质等特点。为阐明该酶具有优良性能的原因,本论文通过生物信息学分析和定点突变的方法研究影响Y.e.p非特异性核酸酶酶活和热稳定性的因素,为进一步研究Y.e.p非特异性核酸酶的功能进化奠定基础。主要研究内容和结果如下:(1)用生物学软件全面分析Y.e.p非特异性核酸酶的一级结构、二级结构、结构域和叁级结构,为Y.e.p非特异性核酸酶的定点突变研究提供理论基础。(2)通过对Y.e.p非特异性核酸酶活性位点、盐桥和二硫键定点突变的研究,改变活性位点氨基酸、破坏盐桥和二硫键组成,发现Y.e.p非特异性核酸酶酶活和热稳定性急剧下降,说明活性位点对维持Y.e.p非特异性核酸酶的酶活,盐桥和二硫键对维持Y.e.p非特异性核酸酶的热稳定性具有重要作用。(3)序列比对热不稳定Y.e.e非特异性核酸酶和热稳定Y.e.p非特异性核酸酶,对差异氨基酸进行定点突变,结果发现E202A,I203F,D264E这叁个位点氨基酸的改变能引起酶活及热稳定性变化,由此推测Glu202,Ile203和Asp264可能是影响Y.e.p非特异性核酸酶酶活和热稳定性的关键氨基酸残基。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
结构特异性核酸酶论文参考文献
[1].于昊.硫修饰依赖型核酸酶SprMcrA的活性表征及其序列特异性的结构基础[D].上海交通大学.2018
[2].李珍华.小肠结肠炎耶尔森菌非特异性核酸酶的结构分析及定点突变研究[D].杭州师范大学.2015
[3].刘松柏.结构特异性核酸酶FEN1在DNA复制及细胞周期过程中的功能性研究[D].浙江大学.2014
[4].潘万龙,方岩,许舸,单雪峰,徐蕾.结构特异性核酸酶FEN1对HBV复制的影响[J].第叁军医大学学报.2012
[5].李力.对虾白斑杆状病毒非特异性核酸酶基因的功能鉴定及结构蛋白VP31的鉴定[D].国家海洋局第叁海洋研究所.2005
[6].石斌山,余应年.结构特异性核酸酶FEN-1的功能和结构[J].生物化学与生物物理进展.2000
论文知识图
