蛋白酶体抑制剂syrbactins的组合生物合成和prenylisatin的异源表达

论文摘要

微生物是重要药用化合物的主要来源。为挖掘更多抗肿瘤和抗细菌感染的天然活性药物,本文从组合生物合成和基因组挖掘两个角度来对两类化合物开展研究。1蛋白酶体抑制剂类化合物syrbactins生物合成基因簇的挖掘和组合生物合成蛋白酶体（proteasome）负责降解错误折叠、过量的蛋白,是抗肿瘤药物筛选的分子1靶标。短肽类化合物syrbactins家族被认为是新一代蛋白酶体抑制先导化合物。它们的核心骨架（也是活性中心）十二元内酰胺环母核的生物合成机制类似,都由非核糖体肽合成酶（NRPS）-聚酮合酶（PKS）复合体采用模块化组装方式合成,这种机制可以允许利用组合生物合成技术对其聚酮或聚肽骨架结构进行构效优化。本研究目标是通过基因组挖掘得到更多来源的syrbactins生物合成基因簇,通过理性设计和重新组合,建立syrbactins的“人工”生物合成途径,实现syrbactins的构效优化。1.1 Syrbactins家族基因簇的挖掘和异源表达:为了积累更多模块元件,本研究首先利用GenBank等数据库中大量的细菌基因组及宏基因组信息进行挖掘,利用在线程序Blast进行序列比对和分析,利用antiSMASH进行基因簇预测,发现了许多潜在的syrbactins生物合成基因簇,包含以前研究过的glb、syl、lmm（分别合成丁香霉素（syringolins）、滑杆菌素（glidobactins）、cepafungins 和luminmycins等化合物）以及新发现的Pglb（来自荚壳伯克氏菌PG1（Burkholderi 1 glumae PG1））。因在原始菌中未检测到syrbactins家族产物积累,对Pglb基因簇进行直接克隆、异源表达以及进行启动子的原位插入激活等实验,但均未能激活相应基因簇的表达。1.2 Syrbactins家族异源表达宿主的筛选:为便于进行不同基因簇之间组合生物合成,本研究尝试在白色链霉菌J1074（StreptomycesalbuJ1074）、伯克氏菌DSM 7029(Burkholderial（DSM 7029）、天蓝色天霉菌（Streptomycescoelicolor）等几种常用宿主中异源表达syrbactins生物合成基因簇,期望找到最佳适配性的宿主,以有效表达“人工”的syrbactins生物合成基因簇。目前结果发现:白色链霉菌中,syl可以表达,但glb不能表达;天蓝色链霉菌中,syl和glb均不能表达,伯克氏菌中syl不能表达。尚未找到能同时高效表达glb、Pglb和syl三个基因簇的宿主菌。1.3 Glidobactins生物合成基因簇的阻断与回补:对伯克氏菌DSM 7029基因组上glidobactins生物合成基因glbC和glbF成功进行敲除,获得单基因敲除突变菌株。HPLC-MS分析发现,glbC和glbF敲除突变株没有glidobactins产生,成功阻断了 glidobactins生物合成通路,说明glbC和glbF作为结构基因对glidobactins生物合成非常关键。将构建好的glbC和glbF回补表达质粒电转化到以上敲除突变株中,发现:基因回补后能恢复glidobactins的生产,但产量降低为野生型DSM 7029的10%。1.4 Glidobactins生物合成基因簇结构基因的种间替换:以上面获得的glbC和glbF敲除突变株为基础,尝试利用来自syl以及Pglb基因簇中的同源基因进行结构基因的种间替换（预期发生氨基酸残基的替换）:sylD（与glbC同源）、sylC（与glbF同源）和PglbC（与glbC同源）分别导入DSM7029敲除突变株,替换glbC和glbF。HPLC-MS检测发现,种间结构基因替换未能产生杂合化合物。1.5 Glidobactins生物合成基因簇模块和结构域替换:以直接克隆得到的glidobactins生物合成基因簇glb为基础,分别敲除glbC中的第二个模块和该模块中的腺苷酰化结构域A;随后将来源于syl和PglP两个基因簇中的相应的模块和腺苷酰化结构域无痕插入到glbC中,完成模块替换。最后将构建的“人工”生物合成基因簇导入到敲除了glb的DSM 7029进行表达,结果没有预期的杂合化合物产生（仅产生了二肽结构的化合物）,说明模块和结构域替换导致glidobactins生物合成通路中断。为了消除不同生物来源的syrbactins生物合成基因簇GC含量以及密码子偏好性的影响,我们对用于替换的模块进行了密码子优化,然后重新进行模块和结构域的替换,结果也没有检测到预期化合物。2异戊烯吲哚类化合物prenylisatin的生物合成Prenylisatin是细菌来源的异戊烯吲哚类化合物,具有抗细菌、抗真菌及细胞毒性等特性,是色氨酸在异戊烯基转移酶的催化作用下,在不同位置发生了异戊烯基取代形成的。虽然目前已经发现一系列异戊烯基转移酶,能对吲哚环上所有非桥头原子（N-1、C-2、C-3、C-4、C-5、C-6和C-7）进行异戊烯化,但这类化合物完整的生物合成通路仍未阐明。本研究目标是利用Red/ET直接克隆技术进行基因组挖掘,鉴定异戊烯吲哚类化合物prenylisatin生物合成基因簇,研究其生物合成途径,为进行更多类似化合物的生物合成奠定基础。2.1 Prenylisatin生物合成基因簇的直接克隆和异源表达:我们利用antiSMASH对放线菌“D74”（Streptomycesrochei）基因组进行基因簇预测,发现此菌株含有大量次级代谢基因簇;对其中沉默的基因簇cluster 2进行直接克隆,导入到天蓝色链霉菌A3（2）（Streptomycescoelicolor A3（2））中。HPLC-MS检测证明:异源表达成功激活该基因簇,该化合物m/z 215.6[M+H]+,与文献报道一致。2.2 Prenylisatin生物合成基因簇中单个基因的功能研究:分别对prenylisatin基因簇中包含的17个基因进行单基因同框缺失突变,获得17个单基因突变菌株,然后进行LC-MS分析。结果表明:三个基因isa8、iia9和isal0为prenylisatin生物合成途径中的关键基因,缺失后导致目标产物不再积累。同源性分析表明isa8和iia9分别为色氨酸合成酶和芳香族异戊烯转移酶基因。isal0功能不确定（推测编码转录调控因子）。3总结本研究开展系列组合生物合成研究,利用结构基因替换、模块替换及结构域替换,结合密码子优化等,构建系列syrbactins人工生物合成途径,但均未得到预期杂合化合物。Syrbactins化合物是通过NRPS-PKS杂合途径合成的,其中的蛋白质-蛋白质相互作用比单一的NRPS或PKS途径更加难以预测,微小的改变也会对整个生物合成途径产生巨大影响,目前有报道关于NRPS模块替换产生新化合物,但罕有NRPS-PKS杂合基因簇模块替换成功的案例报道。从放线菌基因组上直接捕获了 30 kb的prenylisatin生物合成基因簇,并成功进行异源表达和单基因敲除,鉴定三个关键基因（编码色氨酸合成酶、芳香族异戊烯转移酶和未知功能蛋白）,为异戊烯吲哚类天然活性产物组合生物合成提供重要的基因资源。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 第一章 绪论
•   1.1 蛋白酶体抑制剂syrbactins的研究进展
•     1.1.1 Syrbactins化合物家族
•     1.1.2 Syrbactins的生物合成
•     1.1.3 Syrbactins的化学合成
•     1.1.4 Syrbactins的生物活性及药理
•   1.2 蛋白酶体抑制剂类抗癌药物研究进展
•   1.3 非核糖体肽（NRPS）和聚酮（PKS）类化合物组合生物合成研究进展
•     1.3.1 前体定向生物合成和突变合成法
•     1.3.2 前体供应和剪裁酶工程
•     1.3.3 NRPS/PKS亚单位、模块或结构域的替换
•   1.4 基因组挖掘与抗感染药物异戊烯吲哚类化合物研究
•   1.5 合成生物学中应用的关键技术
•     1.5.1 CRISPR/Cas
•     1.5.2 Gibson组装
•     1.5.3 SLIC
•     1.5.4 Red/ET重组工程
•   1.6 立题依据和意义
•     1.6.1 蛋白酶体抑制剂syrbactins的组合生物合成
•     1.6.2 异戊烯吲哚类化合物prenylisatin的生物合成
• 第二章 材料和方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 菌株和质粒
•     2.1.2 培养基和抗生素
•     2.1.3 寡核苷酸合成和DNA测序
•     2.1.4 主要试剂
•     2.1.5 主要实验仪器
•     2.1.6 数据分析软件
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 PCR
•     2.2.2 大肠杆菌质粒提取和酶切鉴定
•     2.2.3 酶切后的DNA沉淀
•     2.2.4 T4 DNA连接
•     2.2.5 革兰氏阴性细菌基因组DNA的制备与酶切
•     2.2.6 Excocet方法处理沉淀的基因组和载体片段
•     2.2.7 大肠杆菌电转化
•     2.2.8 链霉菌的接合转移
•     2.2.9 重组子的发酵及化合物提取
•     2.2.10 HPLC-MS检测
•     2.2.11 菌种保藏
• 第三章 Syrbactins化合物基因组挖掘和组合生物合成研究
•   3.1 Syrbactins家族基因簇的挖掘和异源表达
•     3.1.1 Glidobactins基因簇的直接克隆和在链霉菌中异源表达
•     3.1.2 Pglb的直接克隆和异源表达
•     3.1.3 Pglb的原位激活和失活
•     3.1.4 Syringolins基因簇在Burkholderia DSM 7029中的异源表达
•   3.2 Glidobactins基因簇的阻断与回补
•     3.2.1 Burkholderiales DSM 7029敲除突变株的构建
•     3.2.2 Glidobactins生物合成基因簇中结构基因的回补和替换
•   3.3 Glidobactins基因簇中模块和结构域替换
•     3.3.1 域间融合位点的选择
•     3.3.2 模块替换重组质粒的构建
•     3.3.3 模块替换重组菌株的构建与代谢产物分析
•   3.4 密码子优化以后模块和结构域的替换
•     3.4.1 密码子优化
•     3.4.2 密码子优化后模块替换重组质粒的构建
•     3.4.3 模块替换重组菌株的构建与代谢产物分析
•   3.5 讨论
• 第四章 Prenylisatin化合物基因组挖掘和生物合成研究
•   4.1 娄彻氏链霉菌D74中BGC分析和prenylisatin基因簇同源性分析
•   4.2 Prenylisatin基因簇直接克隆和异源表达
•   4.3 Prenylisatin生物合成基因簇中单个基因的功能研究
•   4.4 讨论
• 第五章 总结与展望
•   5.1 总结
•   5.2 展望
• 参考文献
• 论文发表情况
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘晓彤

导师: 张友明,李爱英

关键词: 蛋白酶体抑制剂,组合生物合成,异源表达

来源: 山东大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,药学

单位: 山东大学

基金: 国家自然科学基金面上项目(No.31670097),山东省重点研发计划(No.2015GSF12101),山东省重大专项(No.2015ZDJS04001),山东省自然科学基金(No.ZR2017MC031)

分类号: Q78;R914

总页数: 113

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