猪繁殖与呼吸综合征病毒PCR检测及部分阳性样品的全基因组序列测定与分析

论文摘要

猪繁殖应呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV）引起的一种以母猪繁殖障碍、流产、木乃伊及仔猪呼吸系统疾病为主要特征的疾病。PRRSV是一种不分节段的单股正链RNA病毒,由于病毒RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA Polymerase）缺少校对功能,使基因在复制过程中容易出现缺失、插入和突变的现象,继而造成PRRSV具有高度的变异性和毒株多样性。本研究运用分子检测与鉴别技术,对河南及周边地区的PRRSV流行情况进行调查,并通过遗传进化和重组性分析,旨在为PRRS的临床诊断和有效防控提供参考依据。1.对2017-2018年河南及周边地区的PRRSV进行分子流行病学调查,并将NSP2序列进行遗传进化分析本试验对241份临床样品进行RT-PCR检测,其中PRRSV阳性共121份。121份阳性中有 92 份类NADC30 PRRSV、24 份 HP-PRRSV、3 份经典型PRRSV、1 份欧洲型 PRRSV,及1份HP-PRRSV与类NADC30混合感染。选择具有代表性的临床样品进行NSP2序列测定,最终获得23个NSP2序列。对23个NSP2序列进行遗传进化分析,结果显示,有10个毒株在NSP2 区域存在131个氨基酸的不连续缺失,与NADC30毒株序列一致性较高;有10个毒株在NSP2区域存在30个氨基酸的不连续缺失,与JXA1毒株序列一致性较高;有2个毒株NSP2序列与CH-1a毒株一致较高;另有1个毒株NSP2序列与Lelystad virus毒株一致性较高,且在NSP2区域连续有54个氨基酸的缺失。PRRSV毒株的NSP2基因变异程度较大,同时在猪群中各种基因型共同存在,加深了PRRSV在田间流行的复杂性。因此有必要对PRRSV的流行和变异进行持续监测,为PRRSV的临床诊断和有效防控提供参考依据。2.PRRSV类NADC30毒株全基因序列测定和重组分析为进一步了解河南地区类NADC30毒株的遗传变异情况,对检测到的部分毒株进行全基因序列测定,共获得10个类NADC30毒株的全基因序列。同源性分析结果显示:10个毒株与VR2332株的核苷酸序列同源性为84.8%-86.8%,与JXA1株的同源性为83.4%-88.5%,与美国NADC30株的同源性为90.1%-94.8%。遗传进化分析显示:10个毒株均位于以NADC30为代表的NADC30-Like亚群,且10个毒株在遗传进化树中所处分支与HNjz15及HENAN-HEB更近。重组性分析显示:10个毒株中有4个毒株未发生重组;有6株与HP-PRRSV发生重组,其中5株在非结构蛋白处发生重组,另1株在非结构蛋白和结构蛋白处均发生重组。本研究为深入分析类NADC30毒株在我国的变异与重组提供了参考。3.3株类NADC30毒株的分离与鉴定本试验将检测到的3份类NADC30临床样品研磨液接种PAM细胞进行病毒分离,对细胞培养物进行RT-PCR鉴定,成功分离到3株病毒。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• 英文缩略表
• 第一章 文献综述
•   1.1 引言
•   1.2 PRRSV病原学研究
•     1.2.1 分类
•     1.2.2 分型及形态结构
•   1.3 PRRSV基因组特征
•     1.3.1 非编码区
•     1.3.2 非结构蛋白
•     1.3.3 结构蛋白
•   1.4 我国PRRSV遗传演化及流行趋势
•   1.5 猪繁殖与呼吸练合征分子诊断技术研究进展
•     1.5.1 常规RT-PCR
•     1.5.2 巢式RT-PCR
•     1.5.3 实时荧光定量PCR
•   1.6 研究目的及意义
• 第二章 2017-2018年河南及周边地区PRRSV分子检测及NSP2基因遗传进化分析
•   2.1 引言
•   2.2 材料
•     2.2.1 病料及处理
•     2.2.2 主要试剂
•     2.2.3 主要设备
•     2.2.4 引物设计与合成
•   2.3 方法
•     2.3.1 样品的准备
•     2.3.2 提RNA
•     2.3.3 反转录
•     2.3.4 临床样品的PCR检测
•     2.3.5 NSP2基因扩增
•     2.3.6 目的片段的回收与纯化
•     2.3.7 PCR产物与pEASY-Blunt Cloning Vector的连接转化
•     2.3.8 菌液PCR鉴定
•     2.3.9 NSP2基因的遗传进化分析
•   2.4 结果与分析
•     2.4.1 临床样品的分子检测结果
•     2.4.2 NSP2基因的扩增结果
•     2.4.3 NSP2基因核苷酸及推导氨基酸序列的同源性分析
•     2.4.4 NSP2基因推导的氨基酸序列变化特征
•     2.4.5 NSP2基因的遗传进化分析
•   2.5 讨论
•   2.6 小结
• 第三章 类NADC30毒株全基因序列测定与分析
•   3.1 引言
•   3.2 材料
•     3.2.1 病料选取
•     3.2.2 主要试剂
•     3.2.3 主要设备
•     3.2.4 引物设计与合成
•   3.3 方法
•     3.3.1 样品的准备
•     3.3.2 提RNA
•     3.3.3 反转录
•     3.3.4 全基因组序列测定
•     3.3.5 目的片段的回收与纯化
•     3.3.6 PCR产物与pEASY-Blunt Cloning Vector的连接转化
•     3.3.7 分子生物学分析软件
•   3.4 结果与分析
•     3.4.1 10个毒株的全基因组扩增
•     3.4.2 全基因核苷酸序列同源性分析
•     3.4.3 全基因序列的遗传进化分析
•     3.4.4 GP5蛋白N-糖基化位点的变化特点
•     3.4.5 全基因序列的重组分析
•   3.5 讨论
•   3.6 小结
• 第四章 3株类NADC30毒株的分离与鉴定
•   4.1 引言
•   4.2 材料与方法
•     4.2.1 材料
•     4.2.2 方法
•     4.2.3 3份PRRSV毒株的分离与培养
•     4.2.4 分离病毒的鉴定与分型
•     4.2.5 RT-PCR检测
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 PRRSV分离培养结果
•     4.3.2 分离PRRSV细胞液的RT-PCR检测
•   4.4 讨论
•   4.5 小结
• 第五章 全文总结
• 参考文献
• ABSTRACT

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李天宇

导师: 张许科,张龙现

关键词: 基因,类毒株,遗传变异,重组

来源: 河南农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 河南农业大学

分类号: S852.651

DOI: 10.27117/d.cnki.ghenu.2019.000257

总页数: 55

文件大小: 3871K

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