刘海珠常鑫隋振耿(山东省威海市立医院264200)
【关键词】细菌耐药性检测方法
【中图分类号】R446.5【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）02-0355-02
1耐药表型检测
1.1β－内酰胺酶检测细菌产生的β－内酰胺酶能水解青霉素及头孢菌素类抗生素的基本结构β－内酰胺环，使抗生素灭活造成细菌耐药。β－内酰胺酶试验主要方法有头孢硝噻吩纸片法和碘－淀粉测定法，临床常用头孢硝噻吩纸片法。对于革兰阳性球菌，直接用无菌牙签挑取16～20h的菌落或其细菌悬液涂抹头孢硝噻吩纸片；对于革兰阴性杆菌，提取细菌裂解液涂抹头孢硝噻吩纸片。8～10min后观察结果，纸片由黄色变为红色为阳性，表示产生β－内酰胺酶。每次试验应设已知的产酶阳性菌和阴性菌做对照。β－酰胺酶试验阳性预示待测菌株如流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、淋病奈瑟菌和葡萄球菌等对青霉素(如氨苄西林、阿莫西林等)耐药。
1.2超广谱β－内酰胺酶检测超广谱β－内酰胺酶(ESBL)是一种能水解青霉素、头孢菌素及单环类的新型β－内酰胺酶，其临床常用的检测方法有初筛试验及确证试验。
1.2.1初筛试验操作方法同K－B法，并使用1种以上药物。抑菌圈直径用R表示，按以下条件进行判断：①对于肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌，若R(头孢泊肟)≤17mm、R(头孢他啶)≤22mm、R(氨曲南)≤27mm、R(头孢噻肟)≤27mm，则初筛为产ESBL菌株；②对于奇异变形杆菌，若R(头孢泊肟)≤22mm、R(头孢他啶)≤22mm、R(头孢噻肟)≤27mm，则初筛为产ESBL菌株。
1.2.2确证试验操作方法同K－B法，同时使用两组四种纸片：头孢他啶(30μg)、头孢他啶/克拉维酸(30/10μg)及头孢噻肟(30μg)；头孢噻肟/克拉维酸(30/10μg)。其结果为两组中任何一组药物加克拉维酸与不加克拉维酸的抑菌圈相比，抑菌圈直径增大值大于或等于5mm时判断为产ESBL菌株。ESBL主要由克雷伯菌、大肠埃希菌等革兰阴性产生。产ESBL克雷伯菌和大肠埃希菌不论其体外药物敏感试验结果如何，用青霉素、头孢菌素和氨曲南治疗均无效。
1.2.3耐甲氧西林葡萄球菌检测耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)包括：①对1μg苯唑西林纸片的抑菌圈直径不超过10mm(或MIC≥4μg/mL)，或对30μg头孢西丁纸片抑菌圈直径不超过19mm的金黄色葡萄球菌；②对1μg苯唑西林纸片的抑菌圈直径不超过17mm(或MIC≥0.5μg/mL)，或对30μg头孢西丁纸片抑菌圈直径不超过24mm的凝固酶阴性葡萄球菌。
1.2.4D试验－克林霉素诱导耐药试验
对大环内酯耐药的葡萄球菌可能对克林霉素耐药。纸片法D试验检测：使用M－H平板或血平板。试验菌为葡萄球菌，则在距红霉素纸片(15μg)边缘15～26mm处放置克林霉素纸片(2μg)；试验菌为β－溶血链球菌，则克林霉素纸片(2μg)和红霉素纸片(15μg)边缘相距12mm。在35℃孵育16～24h后观察靠红霉素纸片一侧的克林霉素纸片周围抑菌环有无出现截平现象(称为“D”形抑菌环)。
1.2.5耐万古霉素和高水平氨基糖苷类肠球菌检测
1.2.5.1耐万古霉素肠球菌检测对30μg万古霉素纸片抑菌圈直径不超过14mm，或MIC≥32μg/mL，应视为耐万古霉素肠球菌(VRE)。对万古霉素多重耐药菌目前尚无有效治疗方法。对青霉素敏感的VRE可用青霉素与庆大霉素联合治疗；若对青霉素耐药但不是高水平耐氨基糖苷类VRE，则可用替卡拉宁与庆大霉素联合应用进行治疗。
1.2.5.2耐高水平氨基糖苷类肠球菌检测肠球菌对120μg庆大霉素纸片抑菌圈直径不超过6mm(或MIC≥500μg/mL)时，对300μg链霉素纸片抑菌圈直径不超过6mm(MIC≥1000μg/mL(肉汤)或MIC>2000μg/mL(琼脂))时，则视为耐高水平氨基糖苷类肠球菌(HLAR)。
2耐药基因型检测
2.1DNA扩增技术通过PCR引物扩增目标DNA，凝胶电泳成像，和标准菌株或marker比较，判断耐药基因的型别，然后将其耐药基因转移至受体菌，通过扩增能否产生相同片段，观察其耐药表型；也可采用多重PCR，测定多个耐药基因。也可用限制性片段长度多态性分析(PCR－RFLP)、单链构象多态性分析(PCR－SSCP)等方法，测定已知和未知的耐药基因，了解核苷酸的序列的突变和空间构象。
2.2基因芯片技术基因芯片可用于病原微生物耐药基因的表达谱检测、突变分析、多态性的测定。病原体的耐药基因的检测可通过两种方式：表达谱芯片检测药物诱导的基因表达改变来分析其耐药性；寡核苷酸芯片检测基因组序列的亚型或突变位点从而分析其耐药性。
参考文献
[1]张印俊.病原菌对抗菌药物的耐药机制[J];国外医药(抗生素分册);2002年05期.
[2]陈民钧.细菌耐药性及其临床意义[J];中华外科杂志;1998年S1期.
[3]苏玉严.细菌耐药性研究现状与对策[J];中国热带医学;2008年09期.