基于跨膜蛋白研究提高Lactococcus lactis NZ9000酸胁迫抗性

论文摘要

乳酸菌因其优良的性能被广泛应用于众多领域,但在发酵过程中菌株因遭受酸胁迫,导致细胞生长和代谢活性的显著下降,抑制菌株发挥益生功能。因此,提高乳酸菌的酸胁迫耐受性尤为迫切。作为酸胁迫的首要靶点,细胞膜以多种方式抵御酸胁迫对细胞的损伤,但目前应用膜蛋白提高乳酸菌酸胁迫抗性的研究还鲜有报道。本论文在Lactococcus lactis NZ9000中过量表达多种膜蛋白基因,利用转录组学与分子生物学手段,确定了部分与酸胁迫抗性相关的抗酸元器件。通过在L.lactis NZ9000中过量表达酸胁迫条件下表达水平显著上调的膜蛋白基因,筛选获得耐酸重组菌株L.lactis（ZitP）和L.lactis（ZitQ）,其存活率分别是对照菌株L.lactis（pNZ8148）的14.5和9.5倍（pH 4.0乳酸胁迫4 h）;酸胁迫条件下,重组菌株胞内pH维持相对平衡,且胞内ATP含量均高于对照菌株,pH 4.0胁迫3 h后,L.lactis（ZitP）和L.lactis（ZitQ）胞内ATP含量分别为对照菌株的7.7和11.7倍。为揭示ZitP（金属离子ABC转运蛋白通透酶）和ZitQ（金属离子ABC转运ATP结合蛋白）膜蛋白帮助细胞抵御酸胁迫的作用情况,本研究利用比较转录组学的方法分析了重组菌株和对照菌株在正常条件和酸胁迫条件下的差异基因表达。结果表明,编码ABC转运家族蛋白（ecfA2和azlC）和金属离子转运蛋白（mtsC和zitS）的基因显著上调;一些转录调控因子（MarR家族转录调控因子、spxA基因）和应激蛋白（cspABD2）发生显著上调,推测这些基因的差异表达有助于保护细胞免受致死环境的损害。基于转录组学分析发现,在L.lactis（ZitP）和L.lactis（ZitQ）中显著上调的膜蛋白基因分别有7和6个,共有的差异表达上调的基因有10个。结合分子生物学操作,从上述显著上调的基因中验证并获得抗酸元器件secG（前蛋白转位酶亚基）、ecfA2（能量偶联因子转运蛋白ATP酶）和purC（磷酸核糖氨基咪唑-琥珀酰胺合酶）,其过量表达重组菌株的存活率分别是对照菌株L.lactis（pNZ8148）的20.9、598.7和83.2倍（pH 4.0乳酸胁迫4h）。进一步研究发现,重组菌株L.lactis（SecG）和L.lactis（EcfA2）胞内ATP含量明显高于对照菌株,胁迫条件下,胞内ATP含量分别为对照菌株的6.5和4.8倍,为细胞抵御酸胁迫提供能量;而L.lactis（PurC）在酸胁迫条件下能够产生较多的胞内天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸和γ-氨基丁酸,促进细胞抵御酸胁迫。膜蛋白ZitP和ZitQ与抗酸元器件共表达的效果分析表明,共表达重组菌株L.lactis（ZitP/SecG）、L.lactis（ZitQ/EcfA2）、L.lactis（ZitP/PurC）和L.lactis（ZitQ/PurC）的存活率分别是对照菌株L.lactis（pNZ8148Dual）的3.7、54.9、174.3和102.8倍（pH 4.0乳酸胁迫4 h）,证实了上述抗酸元器件组合表达对提升菌株酸胁迫抗性的作用效果。本论文探究了膜蛋白ZitP和ZitQ提高乳酸菌酸耐受性的作用情况,并通过转录组学与分子生物学技术的结合,挖掘并证实了secG、ecfA2和purC元器件的抗酸作用效果,为构建耐酸工业菌株提供了新的思路。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 概述
•     1.1.1 乳酸菌及其应用
•     1.1.2 乳酸菌面临的环境胁迫
•   1.2 国内外研究进展
•     1.2.1 乳酸菌的酸胁迫响应机制
•     1.2.2 提高乳酸菌酸胁迫抗性的策略研究
•     1.2.3 应用膜蛋白抗酸元器件提高酸胁迫抗性的研究
•   1.3 本论文立题依据和研究意义
•   1.4 本论文主要研究内容
• 第二章 材料与方法
•   2.1 材料
•     2.1.1 菌株和质粒
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 仪器
•     2.1.4 培养基与培养条件
•   2.2 分子生物学操作
•     2.2.1 质粒和L.lactis NZ9000 基因组的提取
•     2.2.2 E.coli MC1061 感受态的制备与热激法转化
•     2.2.3 L.lactis NZ9000 感受态的制备与电转化
•     2.2.4 单表达载体的构建
•     2.2.5 共表达载体的构建
•   2.3 酸胁迫实验
•     2.3.1 乳酸胁迫实验
•     2.3.2 乙酸胁迫实验
•   2.4 生理指标的测定
•     2.4.1 菌株生长性能与乳酸发酵性能测定
•     2.4.2 胞内ATP浓度的测定
•     2.4.3 胞内pH含量的测定
•     2.4.4 胞内氨基酸浓度的测定
•     2.4.5 蛋白浓度的测定
•   2.5 转录组学实验
•     2.5.1 总RNA的提取
•     2.5.2 RNA测序
•     2.5.3 转录组数据分析
•     2.5.4 实时定量PCR（qRT-PCR）分析验证
• 第三章 结果与讨论
•   3.1 过量表达膜蛋白ZitP和 ZitQ对菌株酸胁迫抗性的影响
•     3.1.1 表达载体的构建以及膜蛋白ZitP和 ZitQ的筛选
•     3.1.2 L.lactis（ZitP）和L.lactis（ZitQ）生长与乳酸发酵性能的测定
•     3.1.3 L.lactis（ZitP）和L.lactis（ZitQ）胞内ATP与 pH含量的测定
•     3.1.4 L.lactis（ZitP）和L.lactis（ZitQ）乙酸胁迫条件下存活率的测定
•   3.2 过量表达膜蛋白ZitP和 ZitQ提高细胞酸胁迫耐受性的作用机制解析
•     3.2.1 过量表达膜蛋白ZitP和 ZitQ重组菌株与对照菌株的差异表达基因分析
•     3.2.2 差异表达基因的GO功能和Pathway显著性富集分析
•     3.2.3 关键差异表达基因的功能分析
•     3.2.4 关键差异表达基因的qPCR验证
•   3.3 过量表达膜蛋白SecG和 EcfA2 对菌株酸胁迫抗性的影响
•     3.3.1 基于过量表达膜蛋白ZitP的共表达载体构建与膜蛋白SecG的筛选
•     3.3.2 基于过量表达膜蛋白ZitQ的共表达载体构建与膜蛋白EcfA2 的筛选
•     3.3.3 L.lactis（SecG）和L.lactis（EcfA2）菌株的构建与乳酸胁迫存活率的测定
•     3.3.4 L.lactis（SecG）和L.lactis（EcfA2）生长与乳酸发酵性能的测定
•     3.3.5 L.lactis（SecG）和L.lactis（EcfA2）乙酸胁迫条件下存活率的测定
•     3.3.6 L.lactis（SecG）和L.lactis（EcfA2）胞内ATP含量的测定
•   3.4 过量表达嘌呤代谢中purC基因对菌株酸胁迫抗性的影响
•     3.4.1 基于共有差异基因的表达载体构建与purC基因的筛选
•     3.4.2 L.lactis（PurC）生长与乳酸发酵性能的测定
•     3.4.3 L.lactis（PurC）乙酸胁迫条件下存活率的测定
•     3.4.4 重组菌株L.lactis（PurC）酸胁迫条件下胞内氨基酸含量的测定
•     3.4.5 L.lactis（ZitP/PurC）和L.lactis（ZitQ/PurC）乳酸胁迫条件下存活率的测定
• 主要结论与展望
•   主要结论
•   展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨佩珊

导师: 张娟

关键词: 乳酸乳球菌,酸胁迫,转录组学,膜蛋白,抗酸元器件

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,生物学,轻工业手工业

单位: 江南大学

基金: 国家自然科学基金面上项目(31470160),“973”项目(2013CB733902)

分类号: Q935;TS201.3

总页数: 60

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