导读:本文包含了疟疾免疫论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:疟疾,脑疟,免疫调节,免疫病理损伤
疟疾免疫论文文献综述
崔爱[1]（2018）在《疟原虫新型分子-TIP在伯氏疟原虫各期的表达定位及对鼠脑型疟疾的免疫作用》一文中研究指出目的:疟疾,由疟原虫经媒介按蚊叮咬传播引起的一种全球性、严重威胁人类健康的寄生虫类疾病。世界卫生组织将其与结核病、艾滋病并称为二十一世纪全球叁大首要人类公共卫生问题。在全球性疾病的比例中疟疾占有很大的比重负担,目前约有2亿疟疾病例,每年约43万人死于疟疾。尽管过去15年里医学研究在消灭疟疾方面取得了相当大的进展,但是伴随着按蚊对杀虫剂抗药性的增强、疟原虫对常用抗疟药物青蒿素、氯喹等耐药性的产生以及现阶段仍缺乏高效的抗疟疫苗,使得疟疾的治疗与防控仍是目前人类面临的一项艰巨任务。脑型疟疾(cerebral malaria,CM):凶险型疟疾临床类型的一种,最为常见,病情亦最为严重。其主要由恶行疟原虫感染所致,且为5岁以下的儿童感染疟疾的主要死因。学者们普遍认为脑疟的发生主要与患者机体内过度的炎症免疫反应相关。过度产生的炎性因子促使内皮细胞黏附分子如:CD36、CSA和ICAM-1等表达水平上调,增加了疟原虫感染的红细胞(pRBC)、血小板和淋巴细胞在微循环内的聚集,进而堵塞微循环,刺激了血管内皮细胞产生过多内皮素-1等其他物质,进而造成了脑血管收缩、脑组织乏氧。组织病理学亦证实,脑疟发生的病理基础是pRBC黏附于血管内皮细胞,滞留在深部脑血管内,引起微循环障碍。引起脑疟死亡的机制目前尚不十分清楚,有很多对脑疟发生发展的假说,但是仍无确切定论。目前CM的致死率高达10~20%,导致死亡的人数占疟疾总人数的80%,即使有幸存活下来,仍有10%~20%的幸存者留有神经系统类的后遗症。因此,更好地研究并阐明CM的发生机制,制定有效合理的预防与治疗策略是亟待解决的重要问题。关于疟疾发生过程中疟原虫对宿主作用的研究近年来有了一些新的发现。曾有研究表明,疟原虫表达或分泌的某种蛋白能够参与调节宿主的免疫应答。Fiscella等研究者发现在哺乳动物体内存在一种T细胞免疫调节蛋白(T cell immunomodulatory protein,TIP)。他们的研究证实,在宿主抗急性移植免疫模型的鼠体内,TIP能够明显抑制移植物引起的免疫排斥反应,具有类似保护作用。Nono等人研究发现在多房棘球绦虫早期的棘球蚴体内存在一种TIP同系物-EmTIP蛋白,EmTIP能够分泌到早期棘球蚴体外,参与调节宿主Th1型免疫效应。Kaczanowski等通过生物信息学方法分析比对发现,在疟原虫的基因组中存在一个与哺乳类体内TIP具有同源性较高的蛋白同系物,将其注明为假设蛋白“Q813H7”。疟原虫TIP同系物(PbTIP)在疟原虫体内的存在及其作用、功能目前尚未见报道,因此PbTIP的定位与相关研究成为了我们关注的焦点。为此,我们对疟原虫TIP的分布、定位以及能否如同哺乳类动物体内存在TIP具有的功能相同或相似而在脑疟的发生发展过程中发挥类似的免疫保护性调节作用成为我们研究的重点,旨在为CM病理损伤提供有效防治的依据,进而针对脑疟制定出更加有效的治疗策略。研究方法:1、应用生物信息学对PbTIP进行分析。Plasmodium berghei TIP(PbTIP)基因筛选于疟原虫数据库PlasmoDB。应用SMART预测分析PbTIP蛋白特性。BLAST与ClustalW进行疟原虫种属同源性alignment分析。2、P.berghei ANKA裂殖体/配子体/动合子培养与分离。裂殖体:小鼠腹腔注射pRBC,感染率达5%~10%左右,心脏采血与裂殖体培养基混匀培养,55%Nycodenz分离液梯度密度分离。配子体:小鼠腹腔注射pRBC,小鼠感染的第4天给予小鼠饮用磺胺嘧啶饮用水,待第6天心脏采血置于48%(v/v)Nycodenz分离液中进行梯度密度分离。动合子:小鼠腹腔注射pRBC,感染第3天,心脏采血混合于动合子培养液中。62%Nycodenz分离液梯度密度分离。3、PbTIP---mRNA表达阶段的初步检测。pRBC腹腔感染BALB/c小鼠,饥饿饲养的雌性按蚊吸食鼠血液,第15、21天提取按蚊中肠(卵囊阶段)与唾液腺(子孢子阶段)保存于Trizol中。取24h和48h疟原虫感染的小鼠肝组织,保存于Trizol中。P.berghei ANKA培养与分离的裂殖体、配子体、动合子亦保存于Trizol中。Trizol法提取各样品RNA。应用TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser二步法反转录试剂盒获得各样品cDNA,特异性引物RT-PCR法检测各阶段PbTIP的表达情况。4、PbTIP HA-tag型疟原虫的克隆与鉴定。依据PlasmoGEM提供的实验流程将线性化的PbTIP HA-tag进行电转,与成熟裂殖体进行基因同源重组。基因组整合了hDHFR作为药物压力选择基因,经乙胺嘧啶药物筛选获取带有hDHFR耐药型的疟原虫。PCR方法对耐药型疟原虫进行鉴定。5、PbTIP基因片段(rPbTIP)扩增与pET32a-rPbTIP表达载体的构建。小鼠腹腔注射pRBC,感染率达30%左右,提取疟原虫全虫DNA。以DNA为模板,特异性引物扩增目的片段基因,T4连接酶与经双酶切消化过的原核表达载体pET32a(+)进行连接反应,连接后的载体转入到宿主菌E.coil BL-21进行片段蛋白表达。6、rPbTIP片段蛋白表达与纯化。菌落置于LB液体培养基中,菌液OD值达到0.4-0.6时加入终浓度为1.0mM的IPTG进行诱导。诱导上清液过滤后经镍氨叁乙酸琼脂糖树脂进行蛋白纯化。纯化且浓缩后的目的蛋白rPbTIP经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。7、小鼠多克隆抗血清的制备。BALA/c小鼠随机分为2组。实验组为重组片段蛋白rPbTIP免疫组,对照组为PBS组。纯化浓缩后的rPbTIP与完全弗氏佐剂混合,皮下多点注射免疫小鼠。再于第3周,第5周与不完全弗氏佐剂混合,分别给予两次加强免疫。ELISA检测多克隆免疫血清抗体滴度。8、rPbTIP免疫抗血清对分离提取的P.berghei ANKA裂殖体/配子体/动合子各期核蛋白、胞浆蛋白与膜蛋白进行Wertern Blot检测。小鼠腹腔注射pRBC,感染率约30%左右,心脏采血。血细胞置于0.17M NH4Cl中冰上裂解红细胞,Nycodenz分离液对各期虫体进行梯度密度分离,分离纯化所得各期虫体按照Invent Biotechologies蛋白分离提取试剂盒指导步骤提取各期不同组份蛋白进行Wertern Blot检测。9、应用IFA法,利用所获得rPbTIP免疫抗血清对PbTIP进行表达定位。提取血液中各阶段疟原虫,4%多聚甲醛固定。一抗为稀释后的抗rPbTIP免疫血清进行孵育,二抗加入FITC标记的山羊抗鼠IgG,DAPI核染色,OLYMPUS BX53显微镜成像仪观察,Adobe Photoshop处理图片。10、PbTIP基因敲除型伯氏疟原虫株的构建与鉴定。应用双交叉同源基因重组技术构建目的基因敲除型疟原虫株。利用hdhfr表达结构替换敲除PbTIP目的基因序列。以P.berghei基因组DNA为模板,PCR方法分别扩增3UTR和5UTR。△PbTIP打靶载体完全线性化后进行电转染,经乙胺嘧啶药物筛选获取带有hDHFR敲除型疟原虫,外周血提取基因进行△PbTIP鉴定。11、鼠脑疟模型的建立与实验分组。除正常对照组外,C57BL/6小鼠经腹腔感染pRBC后随机分为二组:一组为野生PbA感染+PBS尾静脉注射处理组(PBS组),另一组为野生PbA感染+rPbTIP尾静脉注射处理组(rPbTIP组)。rPbTIP组每日1次,分别于第0、1、3、5、7天每日小鼠尾静脉注射rPbTIP 2mg/kg。12、小鼠血脑屏障通透性(BBB)检测。感染的第6天小鼠出现呼吸浅、体弱无力、肢体瘫痪、步态不稳、阵发性颤抖等脑疟症状,每组随机选取小鼠给予尾静脉注射伊文思蓝染料。1h后麻醉小鼠,生理盐水心脏灌注后取出小鼠脑组织浸入到甲酰胺液体中,630nm分光光度计下检测上清液中Evens blus含量。13、免疫组化与HE染色。小鼠在感染第6天出现脑疟症状。每组随机选取小鼠,取脑组织进行组织学检查。脑组织切片用于苏木精-伊红(HE)染色及黏附因子ICAM-1、VCAM-1、CD36抗体组化染色。观察鼠脑疟模型中脑组织微血管阻塞与渗漏情况。14、RNA提取及real time-PCR方法对两组细胞因子水平的检测比较。感染第0、3、5、7天随机选取每组小鼠,无菌条件下取出小鼠脾脏与脑组织,传统Trizol法提取RNA。应用TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser二步法反转录试剂盒获得各样品cDNA。上述cDNA为模板,各特异性引物进行real-time-PCR反应,比较PBS组与rPbTIP组脑组织内VCAM-1、ICAM-1和CD36与脾脏内CXCL9,CXCL10和CXCR3的RNA表达差异。15、脾细胞培养。在感染第0、3、5、7天随机取出每组小鼠,无菌条件下取出小鼠脾脏。筛网研磨小鼠脾组织制备细胞悬液获取脾细胞,终浓度调整为10~7/mL,于24孔细胞培养板中培养备用。16、ELISA法检测脾细胞培养上清与血清中细胞因子的表达水平。分别在感染第0、3、5、7天随机选取每组小鼠,无菌条件下心脏采血,离心取血清。R&D Systems ELISA试剂盒分别检测已收集的脾细胞上清培养液与血清中IFN-γ,TNF-α,IL-1,IL-12,IL-10和TGF-?细胞因子的表达水平。17、流式细胞检测。在感染的第0、3、5、7天,每组随机选取小鼠,无菌条件下取出小鼠脾脏,筛网研磨小鼠脾组织,悬浮脾细胞,计数细胞浓度,调整脾细胞终浓度为10~7/mL。待测细胞进行特异性抗体染色,每管流式管中加入4%多聚甲醛固定上机待测。18、统计方法。数据结果使用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析,计算各组数据均值±标准误。组间组内差异采用独立样本t检验方法或单因素方差分析。各组生存差异性分析采用Kaplan-Meier long-rank检验方法,P<0.05具有统计学差异。研究结果:1、PbTIP生物信息学分析。依据疟原虫数据库PlasmoDB结果显示,疟原虫TIP(PbTIP),ID:PBANKA_124360,基因位于12号染色体上,由703个氨基酸编码蛋白,分子量大小80.4kDa,为一类保守型疟原虫蛋白,目前功能未知。应用生物信息学分析PbTIP在N端有一小段信号肽,并且分别在N,C两端均存在跨膜区。Pfam数据库分析可知,PbTIP属于蛋白质家族PF13517(家族:VCBS)。PbTIP 204-335aa片段结构域在其他物种中也存在。该区域约有100个残基,存在于多个弧菌、Colwellia、慢根瘤菌和Shewanella等其他几种细菌的蛋白中,综合其他物种蛋白大小、重复拷贝数,分布以及蛋白活性提示,PbTIP 204-335aa区域可能具有类似的某种粘附作用,生物信息学分析为后期PbTIP蛋白验证及片段筛选提供了依据。2、PbTIP—mRNA表达水平的检测。提取pRBCs感染小鼠24h、48h的肝组织,疟原虫裂殖体、配子体、动合子及第15天、21天从感染按蚊卵囊阶段与唾液腺子孢子阶段提取的RNA,反转录的cDNA经PbTIP特异性引物扩增。结果发现PbTIP在上述各阶段中mRNA均有表达,说明PbTIP即可以表达在宿主的红外期与红内期,也可表达在传播媒介按蚊体内。可见PbTIP能够存在于疟原虫的整个生活史。3、rPbTIP片段载体构建与片段蛋白表达纯化。成功扩增出rPbTIP片段基因,与Genebank中公布的序列进行比对结果相同。构建的pET32a(+)-rPbTIP载体经过BamHⅠ,XhoⅠ双酶切后进行琼脂糖电泳鉴定,与预期一致,说明rPbTIP片段蛋白载体构建成功。含有pET32a(+)-rPbTIP载体的E.coil BL-21菌株来表达rPbTIP重组蛋白,蛋白经His-tag镍氨叁乙酸琼脂糖纯化,样品经SDS-PAGE电泳在35kDa位置处可见清晰的目的条带,蛋白纯度大于85%,浓度约1mg/mL。片段蛋白经SDS-PAGE电泳和抗His标签抗体Western blot检测,均在35kDa位置呈现清晰的免疫印迹条带,结果证实rPbTIP蛋白表达成功。4、rPbTIP多抗血清的获取与其特异性检测。重组蛋白rPbTIP免疫SPF级6-8周龄雌性BALB/c小鼠,获取多克隆免疫抗血清。ELISA结果显示,初次免疫后第2周小鼠体内血清特异性抗体有显着的升高。随后的两次加强免疫,抗体达到峰值且始终维持在较高水平上。5、Wertern Blot-PbTIP蛋白表达鉴定。获得的裂殖体、配子体、动合子各期核蛋白,胞浆蛋白与膜蛋白30μg/孔上样。rPbTIP多抗免疫血清为抗体与转有疟原虫各阶段不同组份蛋白的PVDF膜进行Wertern Blot反应,结果显示仅膜蛋白在80kDa处有清晰可见的免疫印迹条带。6、IFA-PbTIP检测。利用所获得的的rPbTIP免疫血清对野生疟原虫体内PbTIP不同阶段的疟原虫进行定位,经FITC荧光抗体标记,DAPI染核,结果可见各期疟原虫均在膜表面呈现绿色荧光,与Wertern Blot结果一致,说明PbTIP为伯氏疟原虫表达的一类特异性膜表面蛋白。7、鼠脑型疟疾模型rPbTIP组中脑组织的免疫病理损伤减弱。实验研究比较了PBS,rPbTIP两组第6天小鼠脑组织的病理变化与粘附分子VCAM-1、ICAM-1和CD36表达水平的差异。与PBS组相比,rPbTIP组中作为血脑屏障渗漏的伊文思蓝染料指示剂渗出程度较低,完整脑组织颜色较浅,对照PBS组中脑组织则颜色较深,说明rPbTIP在保护了小鼠血脑屏障的完整性上能够发挥作用。同时可见rPbTIP组每个视野内白细胞沉积的血管数量明显低于PBS组,P<0.05。此外,rPbTIP组脑微血管内皮细胞上相应的粘附分子VCAM-1、ICAM-1和CD36免疫组化统计学分析结果可知,其表达量均降低,P<0.05。rPbTIP组内脑组织VCAM-1、ICAM-1和CD36与脾脏CXCL9,CXCL10和CXCR3的mRNA表达水平同样相应的减弱,P<0.05。8、鼠脑型疟疾模型rPbTIP组内P.berghei感染C57BL/6小鼠的CM发生率降低。PBS组小鼠于第6~12天死亡,但rPbTIP处理组小鼠疟原虫血症水平相对较低,仅有不到30%的小鼠死于ECM,其余小鼠多死亡在感染后第12天且主要死于贫血。9、鼠脑型疟疾模型rPbTIP组研究发现,T细胞介导促炎细胞因子释放减少。比较了PBS与rPbTIP两组中IFN-γ、TNF-α、IL-1和IL-12血清浓度,脾细胞培养上清浓度及脾组织中促炎细胞因子mRNA表达量的变化。与PBS组相比,rPbTIP组中IFN-γ、TNF-α、IL-1和IL-12细胞因子血清浓度、脾细胞培养上清浓度和mRNA表达水平均明显降低。10、鼠脑型疟疾模型rPbTIP组中Tregs与抗炎症细胞因子IL-10/TGF-?的表达增多。与PBS组相比,rPbTIP组中血清和脾细胞培养上清中IL-10和TGF-?表达量增多。脾细胞流式术检测,rPbTIP组中CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg细胞绝对值和百分比明显高于PBS组。结论:1、PbTIP是伯氏疟原虫表达的一类特异性膜表面蛋白。2、鼠脑型疟疾模型rPbTIP组可见脑组织免疫病理损伤减少,血脑屏障完整性增强。3、鼠脑型疟疾模型经rPbTIP处理后缓解了ECM的高发生率。4、鼠脑型疟疾模型经rPbTIP处理后可见Th1细胞介导的过度免疫反应释放的促炎因子有所减少。5、鼠脑型疟疾模型经rPbTIP处理后可见Tregs与抗炎症细胞因子IL-10/TGF-?的表达水平提高。(本文来源于《中国医科大学》期刊2018-05-01）
倪杰明,倪安平[2]（2018）在《疟疾的固有免疫调节机制相关研究进展》一文中研究指出疟疾是一类对人类健康构成严重威胁的传染病,而疟原虫是其致病体。机体对包括疟原虫在内的外来抗原产生的免疫可分为固有免疫和适应性免疫,其中,固有免疫是一类非特异性的免疫反应,单核巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)、树突状细胞(DC)、γδT细胞、细胞因子等为固有免疫的重要组成部分,并与适应性免疫联动,有效抵抗机体疟原虫感染。同时,自噬不仅是细胞内自我降解的过程,也参与调节免疫系统功能,并对抗原虫感染。因此,相应免疫机制的阐述,可以为防治疟疾的相关药物、疫苗研发及临床治疗提供有效帮助。该文就疟疾中固有免疫的构成及其调节机制和相关治疗靶点研究进展进行综述。(本文来源于《中国药理学通报》期刊2018年05期）
官宏莉,蒋莉萍,莫刚,滕萍英,彭小红[3]（2018）在《miR-106b表达下调介导疟疾红内期疫苗免疫保护性下降》一文中研究指出目的探讨miR-106b在疟疾红内期感染后控制疫苗免疫保护性随时间逐渐降低中的作用。方法 C57BL/6小鼠通过尾静脉接种约氏疟原虫P.yoelii 17XNL感染的红细胞,接种小鼠给予氯喹控制红内期感染的发生。接种完成后不同时间点(30 d、90 d、180 d)首先检测小鼠免疫保护性,ELISA检测小鼠血清抗红内期疟原虫抗体滴度,q RT-PCR检测血清miR-106b表达情况。然后,通过流式细胞技术检测脾脏B细胞TACI(transmembrane activator and CAML interactor)表达变化。最后通过体外培养B细胞,加入miR-106b mimic后检测B细胞TACI表达变化。结果免疫后30 d小鼠可产生100%的免疫保护,免疫后90 d小鼠在i RBC攻击后第3天均出现感染,而免疫后180 d小鼠在i RBC攻击后第2天均出现感染。同时,免疫后180 d与30 d相比抗体滴度明显下降(P<0.01),并且小鼠血清中miR-106b的表达也呈现明显的下降趋势。流式细胞分析发现免疫后180 d小鼠脾脏记忆性B细胞(memory B cells,MBCs)表面TACI表达比免疫30 d及90 d小鼠均出现明显下降(P<0.01)。体外培养B细胞加入miR-106b mimic后TACI表达增高。结论疟原虫红内期感染后控制疫苗保护性降低与血清中miR-106b及脾脏MBCs表面TACI表达降低有关,提高miR-106b的浓度可增加MBCs表面TACI的表达。(本文来源于《免疫学杂志》期刊2018年04期）
吴博[4]（2018）在《维生素D与非洲疟疾DALY关系及其预防脑疟免疫机制的研究》一文中研究指出目的:疟疾是一种经按蚊叮咬而感染疟原虫所引起的全球性虫媒传染病,约34亿人存在着感染的风险,目前仍有九十多个国家存在着疟疾,脑疟是疟疾最严重的并发症。在撒哈拉以南非洲地区儿童发病率及病死率高,营养不良被公认是其重要的影响因素之一。近来的研究表明,维生素D(Vitamin D,VD)不足在非洲地区是一个常见的营养不良问题,公众会误认为VD的缺乏应该只发生在赤道南北纬35度以上的区域范围,而在非洲地区生活的人群多靠近赤道,由于得到充足的光照,不会存在VD不足的情况。但现实的研究表明,即使在日照充足的地区,也存在着VD缺乏的问题。除了光源性维生素D来源外,食源性维生素D的缺乏可能是另一个重要的因素。患有重症疟疾儿童的血清VD水平显着低于健康人群的儿童。目前越来越多的科研工作者开始关注维生素D的基础研究,认为其可以通过调节免疫系统发挥其抗感染作用。人类脑型疟疾的分子及细胞机制主要包括促炎细胞因子表达水平的上升、NF-κB通路引起内皮激活导致细胞粘附因子的上调,神经胶质细胞活化及感染红细胞、单核细胞、血小板在脑毛细血管的隔离。近来有研究发现钙叁醇在体外具有抗疟疾能力。有研究报告称,在感染伯氏疟原虫的小鼠中,感染后治疗性使用维生素D可使小鼠感染脑型疟疾的感染率和死亡率降低。为此,我们根据联合国粮食及农业组织(Food and agriculture organization of the united natio,FAO)数据库、美国农业部数据库(United States Department of Agriculture,USDA)、全球疾病负担网站(Global Burden of Disease,GBD),系统地进行了非洲38个国家主要的7种食物消费维生素D水平与非洲疟疾病死率(Death)、伤残调整生命年(Disability Adjusted of Life,DALY)、死亡损失寿命年(Years of Life Lost,YLL)、伤残损失寿命年(years lived with disability,YLD)关系的研究;预防性补充VD对实验脑疟模型(Experimental cerebral malaria,ECM)的免疫调节效应及其相关机制和VD对巨噬细胞RAW264.7的免疫调节效应及其相关机制研究,旨在为疟疾的有效防治提供新的理论依据,从而制定更为有效的抗疟策略。研究方法:1.非洲撒哈拉以南38个国家食物消费维生素D水平计算非洲38个国家7种食物成分中VD含量,得出各国食物消费量日人均维生素D量。以此与各国疟疾DALY进行相关分析,并分为高低剂量组进行比较分析。2.小鼠感染及原虫血症观察通过腹腔注射1×10~6P.b ANKA寄生的红细胞(pRBC)感染小鼠,感染后每日取尾静脉血涂片,Giemsa染液染色,镜检计数红细胞感染率。每日观察小鼠的生存情况和状态,以及是否患有脑疟。3.小鼠VD处理C57BL/6小鼠随机分为4组,分别为正常小鼠未感染组(uninfected),PbA感染组(PbA),PbA感染对照组(油+PbA),Pb感染前预防性补充VD组(VD+PbA)。Pb感染前预防性补充VD组(VD+PbA)在小鼠感染PbA前五天起每日灌胃给予VD(50μg/kg),同时,PbA感染对照组(油+PbA)在VD给药相同时间点给予相同体积的大豆油。4.小鼠血脑屏障通透性检测小鼠感染第五天后各组取小鼠尾静脉注射200μl2%伊文思蓝染料。一小时后,心脏灌注生理盐水,处死小鼠后立即取脑并拍照。将小鼠的脑放入离心管中,每管加入2ml甲酰胺,孵育后离心,取上清液200μl,置于96孔板中,检测波长为630nm的吸光度并计算EB含量。5.巨噬细胞RAW264.7体外培养实验分为四组,分别为只加入培养基的Normol组;只加入有效浓度VD的VD组(浓度为10nM);只加入LPS(1μg/ml)的LPS组为对照组;实验组VD+LPS组中每孔分别加入10nM的VD,再加入1μg/ml的LPS。每组设置2个复孔,培养48小时后分别收上清及细胞。6.RNA提取及Real-time RT-PCR取脑、脾及巨噬细胞RAW264.7提取RNA,用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒去除残存的基因组DNA后,将RNA反转录合成cDNA。用得到的cDNA产物作为模板,进行RT-qPCR反应。采用2~(-ΔΔCT)法量化各个分组的相对基因表达情况。7.ELISA检测取小鼠血清、脾培养上清、脑、巨噬细胞RAW264.7培养上清用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)进行检测。按照试剂盒说明书进行操作。8.流式细胞术制备小鼠脾细胞、脑细胞、巨噬细胞单细胞悬液,染色后用流式细胞仪进行检测,Flowjo软件分析。9.统计学分析所有数据均以均数±标准差(x±s)表示,多组间数据用Prism7统计软件进行多组均数的单因素方差分析(ANOVA),组间比较用q检验,标本采用独立样本t检验比较分析组内和组间均值差异,采用Kaplan–Meyer方法进行生存期分析。P<0.05为显着差异。结果:1.非洲儿童处于维生素D严重不足的状态非洲38个国家平均食物消费维生素D水平很低。各国平均食物消费维生素D与DALY、Death、YLL具有显着负相关。30国家维生素D平均值低于2μg(80IU)/day以下,远低于WHO推荐水平。只有8国高于5μg/day。以此将各国维生素D划分两组进行比较分析,DALY、YLL和YLD均具有显着性差别。2.预防性补充显着升高P.bANKA感染C57BL/6小鼠血清中25(OH)D_3水平感染后第5天,处死小鼠取血清检测小鼠血清中VD含量。结果显示,PbA感染组(PbA)及预防性使用VD组(VD+PbA)的小鼠VD水平可见显着差异,且个体之间差异较大。3.预防性补充VD显着防止P.b ANKA感染的C57BL/6小鼠CM的发生PbA感染组与PbA感染对照组(油+PbA)在小鼠症状、生存期、脑疟发生率、原虫血症等方面并无差异,但与预防性补充VD组(VD+PbA)相比,在各方面均可见显着差异。4.预防性补充VD显着改善实验性脑疟的病理改变PbA感染组(PbA)血脑屏障完整性明显破坏,有很明显的EB外渗,预防性补充VD组(VD+PbA)只可见少量EB外渗。5.预防性补充VD可显着减少T细胞向脑组织迁移感染第5天,两组小鼠脑组织的CXCR3、CXCL9和CXCL10均可见明显升高。预防性补充VD组(VD+PbA)显着降低了脑组织中趋化因子CXCR3、CXCL9及CXCL10的表达。6.预防性补充VD抑制Th1细胞免疫应答,降低IFN-γ、TNF-α水平预防性补充VD组(VD+PbA)小鼠脾细胞中Th1型细胞所占比例明显降低。在血清及脾培养上清中,感染后第5天,预防性补充VD组(VD+PbA)的IFN-γ和TNF-α表达量与PbA感染组(PbA)相比显着降低。与PbA感染组(PbA)相比,预防性补充VD组(VD+PbA)小鼠脾细胞中IFN-γ和TNF-α的mRNA表达水平及小鼠脑细胞IFN-γ和TNF-α的mRNA表达水平亦可见明显的降低。7.预防性使用VD提高Tregs数量并增加IL-10、TGF-β分泌感染第3天,预防性补充VD组(VD+PbA)脾细胞中Tregs的数目明显低于PbA感染组(PbA)脾细胞中Tregs的数目。与PbA感染组(PbA)相比,预防性补充VD组(VD+PbA)小鼠血清TGF-β及脾培养上清IL-10及TGF-β的水平在感染后第5天显着高于PbA感染组(PbA)。8.预防性使用VD抑制DC的分化、成熟及活化在小鼠感染后第5天,PbA感染组(PbA)髓样DCs(mDCs)和浆样DCs(pDC)数量及比例略高于预防性补充VD组(VD+PbA),与PbA感染组(PbA)相比,预防性补充VD组(VD+PbA)DCs共刺激分子MHC-II的比例表达略有降低。9.预防性使用VD抑制分泌IL-1、IL-6、IL-12数据显示,在感染PbA第3、5天,与PbA感染组(PbA)相比,预防性补充VD组(VD+PbA)血清、脾上清的IL-1、IL-6、IL-12水平及脾IL-1、IL-6、IL-12的mRNA表达水平均有明显的减少。对体外巨噬细胞RAW264.7的刺激也显示出相似的结果。10.预防性使用VD抑制NF-κB表达预防性补充VD组(VD+PbA)脾细胞NF-κB的mRNA表达水平显着减少。11.VD可抑制巨噬细胞RAW264.7 TLR4、TLR9及CD40的表达与LPS组相比,VD+LPS组CD40、TLR4、TLR9表达水平明显下降,预防性补充VD组(VD+PbA)TLR4及TLR9的mRNA表达水平与LPS组相比显着下降。12.VD可抑制巨噬细胞RAW264.7 Th1型炎症因子的释放VD+LPS组TNF-α的表达水平与LPS组相比明显降低。除此之外,VD+LPS组的TNF-α的mRNA表达水平显着降低。13.VD可抑制巨噬细胞RAW264.7对淋巴细胞的刺激作用流式细胞术结果表明,LPS刺激可使巨噬细胞RAW264.7 CD80、CD86、MHC-II分子表达水平显着上升,发现CD80、CD86的表达水平VD+LPS组与LPS组相比明显降低,预防性补充VD组(VD+PbA)MHC-II的mRNA表达水平与LPS组有显着下降。结论:非洲38个国家来自食物消费的人均维生素D水平很低,平均值也仅仅是可达4μg/日人均消费维生素D。而30个国家的日人均消费维生素D不足2μg(80IU)以下。远低于WHO推荐的5μg(200IU)和美国医学研究院推荐1-70岁人群的维生素D每日摄入量为15μg(600 IU),70岁及以上为20μg(800IU)。这足以证明,在非洲儿童处于维生素D严重不足的状态。我们对维生素D与DALY的研究结果表明,维生素D是疟疾的保护因素。预防性补充VD可显着防止P.b ANKA感染的C57BL/6小鼠CM的发生,降低小鼠的死亡率,改善实验性脑疟的病理改变。VD可抑制DC的分化、成熟及活化,影响脾脏DCs数量,减少巨噬细胞RAW264.7 CD80、CD86、MHC-II分子表达,进而抑制巨噬细胞RAW264.7的抗原提呈功能。VD还可抑制巨噬细胞RAW264.7TLR4、TLR9及CD40的表达,减少NF-κB通路的作用,并抑制巨噬细胞分泌IL-1、IL-6、IL-12及Th1型炎症因子TNF-α,进一步减少抗原提呈细胞对淋巴细胞的刺激作用。预防性补充VD可抑制Th1细胞免疫应答,提高Tregs数量并增加IL-10、TGF-β分泌,抑制炎症反应的发生。除此之外,预防性使用VD抑制NF-κB表达,也可进一步抑制炎症反应。从而减少脑中趋化因子CXCL9、CXCL10和粘附分子ICAM-1、VCAM-1,的表达,进而降低CD8~+T细胞在脑中的积聚,改善血脑屏障的完整性,最终防止脑疟的发生。(本文来源于《中国医科大学》期刊2018-03-01）
王亚茹[5]（2018）在《促血小板生成素对脑型疟疾的免疫效应特点及相关机制的研究》一文中研究指出目的:脑型疟疾(cerebral malaria,CM)是由恶性疟原虫感染所致,是严重危害人类生命健康的疟疾并发症。大量的文献指出,脑疟的发病机制可能与血小板活化。过度的炎症反应以及微血栓的形成等多种因素相关。因此,如何减少免疫性病理损伤的发生,可能是预防以及治疗脑疟的关键。目前研究发现,在缺血、缺氧、创伤以及炎症损伤的动物模型中,促红细胞生成素(EPO)表现出良好的神经保护作用。并且,在脑疟动物模型中,小鼠经过EPO治疗后,可观察到脑疟发生减少的现象,由此可见,EPO具备了抗CM的作用。促血小板生成素(TPO)作为调节巨核系细胞成熟分化和血小板生成的重要造血因子,和EPO存在着一定的同源性。我们前期实验研究结果显示,尾静脉给予人重组TPO,TPO能够显着抑制感染P.bANKA的C57BL/6小鼠脑疟的发生。和EPO类似,促血小板生成素也是由与配体分子c-Mpl结合而发挥着生物学的作用。目前的研究发现,其配体除了表达于巨核细胞及其前体细胞和血小板之外,还被发现于部分的免疫细胞中,如人类的多形核细胞、树突状细胞(DC)、中性粒细胞等,并可能在一定程度上影响着细胞的免疫功能。因此,本实验拟在已有的工作基础上,将进一步研究TPO对脑型疟疾的免疫调节作用,力求揭示TPO抑制脑疟发生的可能机制,从而为TPO的效应特点阐明以及脑疟的治疗提供新的理论依据。研究方法:构建P.b ANKA感染的C57BL/6小鼠模型,在研究中我们将观察TPO对感染小鼠脾脏中的树突状细胞、Th1免疫应答及炎症水平的影响。同时,DC2.4细胞株进行体外培养,在LPS和/或TPO刺激作用下,通过流式细胞术、ELISA、Real-time PC R等手段观察DC 2.4的TLR和表面分子及NF-κB P65 mRNA水平的影响,与此同时,检测c-Mpl的表达情况。结果:在C57BL/6小鼠模型的体内实验中,我们发现:(1)TPO能够抑制感染小鼠脑疟的发生;(2)TPO可以抑制感染小鼠脾脏中树突状细胞的生物功能;(3)TPO降低了感染小鼠脾脏Th1细胞应答和前炎症因子的表达;(4)TPO能够影响感染小鼠脾脏细胞中NF-κB通路的活化。在LPS刺激DC2.4的细胞模型中,我们发现:(1)TPO抑制DC2.4细胞TLR4的mRNA相对表达水平;(2)TPO抑制DC2.4细胞的成熟活化;(3)TPO降低DC2.4细胞炎症因子的表达水平;(4)TPO抑制DC2.4细胞的c-Mpl的表达。结论:在P.bANKA感染C57BL/6小鼠时,TPO可通过抑制树突细胞生物功能,降低Th1型应答和前炎症因子水平,从而抑制感染小鼠脑疟的发生。在体外实验中,TPO能够降低DC2.4细胞TLR4的表达,同时可抑制相关炎症因子的分泌。这可能与TPO作用于DC2.4的c-Mpl,从而影响了NF-κB通路相关。(本文来源于《中国医科大学》期刊2018-02-01）
[6]（2017）在《新研究发现疟疾躲避宿主免疫系统的机制》一文中研究指出新华社东京2017年12月2日电。疟疾是由疟原虫引起的一种严重的传染性疾病,而且同一个人可能会被多次感染。日本的一项最新研究发现,疟原虫具有躲避免疫系统攻击的机制,这一机制的发现将有助于相关疫苗和治疗药物的研发。日本大阪大学等机构组成的研究团队在英国《自然》杂志网络版上报告说,感染疟原虫后,患者红血球表面会出现一种名为"RIFIN"的特殊蛋白质,它会抑制特定受体,从而抑制宿主的免疫反应,阻(本文来源于《中国社区医师》期刊2017年34期）
郭方霞[7]（2017）在《新型疟疾嵌合抗原M312的纯化工艺及增强其免疫原性的研究》一文中研究指出疟疾是一种古老的疾病,也是世界范围内危害最严重的寄生虫病。本文以我国第一个恶性疟原虫多表位嵌合抗原M.RCAg-1(简称M312)研制中的过程工程难点为对象,解决M312分离纯化过程中不稳定的问题,建立大规模纯化M312的工艺,探索如何增强M312免疫原性,为疟疾疫苗的研制提供工程科学基础。论文的主要创新点如下:(1)发现了 M312在分离纯化中不稳定的原因并确立了对策。通过加入EDTA和咪唑作为分离纯化伴侣,成功抑制了溶液中宿主大肠杆菌蛋白酶对产物的降解,提高了分离纯化的收率。其中咪唑用于分离纯化伴侣未见报道,其保护产物的机制可能是咪唑环与金属蛋白酶发生配位螯合,与EDTA合用导致金属蛋白酶活性降低或者失活,抑制蛋白酶对M312的破坏。(2)建立了以EDTA和咪唑为分离纯化伴侣、以金属螯合层析与高效凝胶过滤层析为主干的分离纯化M312的工艺,在洁净车间批量制备了克级M312,获得了纯度大于95%的目标蛋白,总收率约为600 mg/L培养基。批量制备的M312内毒素残留、宿主蛋白残留和DNA残留都符合美国FDA标准。质谱显示其分子量与理论值一致,圆二色光谱表征其二级结构主要是无规卷曲。与弗氏佐剂配伍免疫小鼠能产生大量的抗原特异性抗体。此外,纯化的M312能够在4℃稳定存放超过6个月。(3)尝试了一种增强M312免疫原性的新策略。将M312与截短的鞭毛蛋白(tFL)共价连接,利用M312上有游离半胱氨酸的特点,通过简单温和的SC-PEG-MAL介导的反应,实现了两个蛋白质的偶联。偶联产物M312-PEG-tFL与残留的修饰剂通过一步离子交换层析实现彼此分离,残留的原蛋白通过一步高效凝胶过滤层析移去。SDS-PAGE显示产物纯度约90%,其中单价偶联物的含量约为50%。圆二色光谱显示偶联产物基本保留了两种原蛋白的高级结构。免疫原性评价显示相比于原始的M312抗原,与tFL交联后的抗原产生了更强的体液免疫应答,并产生大量的特异性抗体。交联产物能够在小鼠中诱导脾细胞产生高程度增殖水平,促进淋巴细胞增殖,并产生大量的记忆T细胞。血清中抗体分型和脾细胞分泌的细胞因子分析发现,单独的M312更倾向于Th2型细胞免疫,而与tFL交联后能够促使Thl型细胞免疫。此外,M312-P5k-tFL使小鼠脾细胞产生更多的TNF-a,表明固有免疫应答更有效,同时tFL保留了 TLR5的活性。(本文来源于《中国科学院大学(中国科学院过程工程研究所)》期刊2017-12-01）
杨丽雪,邓唯唯,高宇辉,王恒[8]（2017）在《恶性疟疾疫苗M.RCAg-1与候选佐剂纳米乳配伍的免疫原性研究》一文中研究指出为了评价纳米乳作为佐剂对恶性疟疾人工重组蛋白疫苗M.RCAg-1免疫原性的影响,将纳米乳佐剂与M.RCAg-1相配伍,于第0、14、28 d肌肉注射免疫小鼠,抗原量为20μg/只。第3次免疫后10 d,眼球取血并取脾细胞。采用ELISA法检测小鼠血清特异性Ig G抗体水平、抗体亚类及其对抗原单表位的识别,用间接免疫荧光反应(IFA)检测抗体对恶性疟原虫天然蛋白的识别,用ELISPOT法检测小鼠脾淋巴细胞免疫应答水平。结果显示疫苗佐剂组小鼠血清中抗M.RCAg-1的抗体水平可达1∶108;疫苗佐剂组产生的特异性Ig G抗体以Ig G1为主;疫苗佐剂组抗体对抗原单表位和天然虫体的识别效果显着。各表位和蛋白诱发免疫小鼠分泌IFN-γ的特异性淋巴细胞克隆数高于分泌IL-4的特异性淋巴细胞克隆数。结果提示纳米乳作为恶性疟疾疫苗M.RCAg-1的佐剂,能够显着提高机体的体液免疫和细胞免疫应答水平。(本文来源于《寄生虫与医学昆虫学报》期刊2017年02期）
杨丽雪[9]（2017）在《纳米乳佐剂与恶性疟疾疫苗M.RCAg-1相配伍后的免疫原性研究》一文中研究指出疟疾是一种虫媒性传染病,主要流行于热带及亚热带地区,与艾滋病、结核病并称为世界叁大传染病,严重威胁着人类的健康。据WHO最新数据统计,2015年全球共发生2.12亿疟疾病例,约有42.9万人死于疟疾,其中多数为撒哈拉以南非洲地区的五岁以下儿童。药浸蚊帐和以青蒿素为基础的联合疗法是减少疟疾发病率的重要策略。但是,随着蚊媒对杀虫剂拟除虫菊酯的耐药性以及疟原虫耐药虫株的出现,使得疟疾的预防和控制手段面临巨大的挑战。由于疟原虫抗原具有阶段特异性、株间变异性、序列多态性等特点,恶性疟原虫红内期疫苗多种候选抗原单独或简单的联合使用时,其免疫效果并不理想。因此,针对恶性疟原虫抗原多样性所构建多表位重组蛋白疫苗具有一定的优势。本课题组前期工作中,利用“表位重组”技术构建了多表位基因库,并筛选出免疫原性最佳、稳定性最好的疟原虫随机重组抗原-1(malaria random constructed antigen-1,M.RCAg-1)。该疟疾疫苗已在小鼠、新西兰兔和非人灵长类动物模型中证实具有较强的免疫原性,并可在体外抑制恶性疟原虫的生长,具有较好的研究前景。本研究的目的是寻找一种安全、有效,并可使M.RCAg-1应用于临床的免疫佐剂。本研究在课题组前期工作的基础上,选用了具有较好研究前景的纳米乳佐剂,选取叁种不同的剂量(剂量A为纳米乳:抗原=7:3;剂量B为纳米乳:抗原=5:5;剂量C为纳米乳:抗原=3:7),将其与M.RCAg-1相配伍,在Balb/C小鼠和新西兰兔体内评价其免疫效果,筛选出最佳纳米乳佐剂剂量组,为M.RCAg-1的临床前研究奠定基础。目前主要取得的进展:1.将叁种不同剂量的纳米乳佐剂与M.RCAg-1相配伍免疫小鼠,均能诱导机体产生较高的体液免疫反应。2.纳米乳剂量A佐剂与M.RCAg-1相配伍免疫新西兰兔,获得疟原虫体外生长抑制率最高32.6%,纳米乳剂量B佐剂与M.RCAg-1相配伍免疫新西兰兔,获得疟原虫体外生长抑制率最高32.7%。3.证实纳米乳单独作为重组蛋白疫苗的佐剂效应弱,提示需要添加其它免疫增强剂。(本文来源于《北京协和医学院》期刊2017-05-01）
马燕妮,Collaborators,Lancet[10]（2016）在《RTS,S/AS01疟疾疫苗有无加强剂情况下在非洲婴儿和儿童中的安全性和免疫效力》一文中研究指出先前已发布了RTS,S/AS01疟疾候选疫苗接种18个月期间的安全性及其效力。这里,作者对此试验包括疫苗加强剂效力的最终结果进行报告。从2009年5月27日到2011年1月31日,非洲亚撒哈拉地区7个国家共11个中心将5~17月(本文来源于《微生物学免疫学进展》期刊2016年06期）
疟疾免疫论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
疟疾是一类对人类健康构成严重威胁的传染病,而疟原虫是其致病体。机体对包括疟原虫在内的外来抗原产生的免疫可分为固有免疫和适应性免疫,其中,固有免疫是一类非特异性的免疫反应,单核巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)、树突状细胞(DC)、γδT细胞、细胞因子等为固有免疫的重要组成部分,并与适应性免疫联动,有效抵抗机体疟原虫感染。同时,自噬不仅是细胞内自我降解的过程,也参与调节免疫系统功能,并对抗原虫感染。因此,相应免疫机制的阐述,可以为防治疟疾的相关药物、疫苗研发及临床治疗提供有效帮助。该文就疟疾中固有免疫的构成及其调节机制和相关治疗靶点研究进展进行综述。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
疟疾免疫论文参考文献
[1].崔爱.疟原虫新型分子-TIP在伯氏疟原虫各期的表达定位及对鼠脑型疟疾的免疫作用[D].中国医科大学.2018
[2].倪杰明,倪安平.疟疾的固有免疫调节机制相关研究进展[J].中国药理学通报.2018
[3].官宏莉,蒋莉萍,莫刚,滕萍英,彭小红.miR-106b表达下调介导疟疾红内期疫苗免疫保护性下降[J].免疫学杂志.2018
[4].吴博.维生素D与非洲疟疾DALY关系及其预防脑疟免疫机制的研究[D].中国医科大学.2018
[5].王亚茹.促血小板生成素对脑型疟疾的免疫效应特点及相关机制的研究[D].中国医科大学.2018
[6]..新研究发现疟疾躲避宿主免疫系统的机制[J].中国社区医师.2017
[7].郭方霞.新型疟疾嵌合抗原M312的纯化工艺及增强其免疫原性的研究[D].中国科学院大学(中国科学院过程工程研究所).2017
[8].杨丽雪,邓唯唯,高宇辉,王恒.恶性疟疾疫苗M.RCAg-1与候选佐剂纳米乳配伍的免疫原性研究[J].寄生虫与医学昆虫学报.2017
[9].杨丽雪.纳米乳佐剂与恶性疟疾疫苗M.RCAg-1相配伍后的免疫原性研究[D].北京协和医学院.2017
[10].马燕妮,Collaborators,Lancet.RTS,S/AS01疟疾疫苗有无加强剂情况下在非洲婴儿和儿童中的安全性和免疫效力[J].微生物学免疫学进展.2016