叶励超
（福建医科大学附属第二医院福建泉州362000）
【摘要】目的：探析维生素D对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠疾病进展的影响。方法：将48只6周龄雌性小鼠随机分6组，每组各8只，其中，A组为维生素D缺乏组免疫10天，B组为维生素D缺乏组免疫16天，C组为维生素D缺乏组免疫30天，D组为小剂量维生素D组免疫10天，E组为小剂量维生素D组免疫16天，F组为小剂量维生素D组免疫30天，A、B、C组均给予维生素D缺乏饲料喂食，而D、E、F组按200IU/只/天的量给予维生素D饲料喂食。观察6组小鼠神经功能评分以及IL-17阳性细胞表达差异。结果：D、E、F组的神经功能评分均较A、B、C组明显降低（P＜0.05），且D组的神经功能评分显著低于E、F组（P＜0.05）；D、E、F组的IL-17阳性细胞数显著少于A、B、C组（P＜0.05）。结论：维生素D可通过抑制IL-17轴调节的免疫机制对自身免疫性脑脊髓炎小鼠发挥神经保护作用，减轻炎性细胞浸润和神经纤维髓鞘脱失，延缓病情发展。
【关键词】实验性自身免疫性脑脊髓炎；小鼠；维生素D；疾病进展
【中图分类号】R965【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2018）21-0393-02
实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是当前临床研究多发性硬化疾病的理想动物模型，主要应用同种的中枢神经系统白质抗原及其类似物诱导而成，其发病机理与病理表现均和多发性硬化相似，病变核心均为免疫反应性炎症。目前已有大量研究证实[1]，白介素-17、白介素-23在多发性硬化并发生、发展中发挥了重要的作用。也有研究报道[2]，维生素D在体内经肝脏、肾脏羟化后可形成1-25二羟基维生素D，进而起到免疫调节作用，适用于多发性硬化的防治。本研究拟建立维生素缺乏和补充的EAE小鼠模型，通过观察EAE发病前期、急性进展期和慢性期小鼠神经功能、IL-17阳性细胞表达差异，进而探析维生素D对EAE小鼠病情进展的影响。
1.实验材料
1.1实验动物
SPF级C57BL/6小鼠，雌性6周龄，体质量20～25g，共48只，购自重庆腾鑫生物技术有限公司。
1.2实验饲料与试剂
维D缺乏饲料（购自江苏特洛菲饲料公司），维生素D饲料自行制作（先将维生素D溶解于无水乙醇中，制备成1mg/ml的溶液备用，同时将琼脂溶解于蒸馏水中制成1%的溶液经加热煮沸后加入不含有维生素D的合成饲料，搅拌均匀，并在琼脂溶液完全凝固之前，将维生素D溶液加入并混匀，制备成含有维生素D的饲料）。维生素D（购自上海生工），免抗小鼠IL-17多克隆抗体、山羊抗兔IgG（美国Sigma公司），完全弗氏佐剂（美国Sigma公司提），百日咳霉素（美国Sigma公司），MOG35-55（上海翊圣生物）等。
2.方法
2.1实验分组方法
将48只小鼠随机分6组，每组8只，其中，A组为维生素D缺乏组免疫10天，B组为维生素D缺乏组免疫16天，C组为维生素D缺乏组免疫30天，D组为小剂量维生素D组免疫10天，E组为小剂量维生素D组免疫16天，F组为小剂量维生素D组免疫30天。
2.2适应性喂养
实验小鼠自购回后保持其自由饮水、进食，温度23～25℃，适应性喂养一周后进入实验。
2.3维生素D缺乏干预处理
A、B、C组则喂食维生素D缺乏饲料；D、E、F组按200IU/只/天（5g/只/天）的量喂食维生素D饲料。每隔一天喂一次，共持续四周。
2.4MOG35-55乳剂制备
用PBS缓冲液将MOG35-55稀释为0.5mg/ml，然后将稀释液与等量的完全弗氏佐剂充分混合，通过三通管将乳剂抽打为完全油包水状态，即为诱导EAE的抗原乳剂。现配现用。
2.5EAE造模
实验鼠称重，腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉（0.5ml/100g），背部备皮，酒精棉球消毒后各小鼠分别于背部中线两侧皮下4点注射抗原乳剂0.2ml。免疫当天（第0d）及48h（第2d）分别给模型各组小鼠腹腔注射百日咳霉素每只500ng（0.2ml），诱导小鼠产生EAE。
2.6小鼠一般状态以及神经功能观察
自免疫当天开始，每天对6组小鼠的精神状态、毛色、粪便等一般状况进行观察，并采用Benson评分标准[3]评估小鼠的神经功能，具体为：0分：无任何临床症状出现；1分：小鼠尾部不能上抬。无张力，见步态轻度笨拙；2分：小鼠双后肢均无力，但在被动翻身后可自行恢复；3分：小鼠双后肢均瘫痪无力，被动翻身后也无法自行恢复；4分：小鼠双后肢已瘫痪，前肢肌力有所减弱，伴大小便失禁；5分：小鼠濒临死亡。
2.7病理学检查
对各组实验鼠称重，腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉（0.5ml/100g），剪开胸腔，暴露心脏，注射针头插入左心室，剪开右心耳，注入PBS缓冲液，继续灌注4%多聚甲醛溶液固定样本组织，取出脊髓与大脑组织，4%多聚甲醛固定用于石蜡包埋。用切片机将石蜡包埋进行切片，每只小鼠的脊髓、大脑组织取3张切片，随后采用苏木精-伊红染色，以免抗小鼠IL-17多克隆抗体为一抗，山羊抗兔IgG作为二抗，严格按照免疫组织化学说明书进行操作，并在光学显微镜下对每张切片进行观察，每个切片选择3个视野记录细胞核完整的免疫组织化学染色阳性细胞。
2.8统计学方法
选用SPSS22.0软件，计量数据以（x-±s）表示，两组组间比较用独立样本t检验，多组组间比较用方差分析，P＜0.05为差异显著。
3.结果
3.1各组小鼠神经功能评分比较
D、E、F组的神经功能评分均较A、B、C组明显降低（F=25.695，P=0.000），且D组的神经功能评分显著低于E、F组（F=4.433，P=0.025），见表1。
3.讨论
有研究报道[4]，多发性硬化的发病主要与遗传、环境、病毒感染以及免疫异常等因素密切相关，且随着对本病研究的不断深入，IL-17在多发性硬化发生发展中的作用机制受到了重视。王利娟的研究也指出[5]，多发性硬化患者血清中的IL-17表达水平较健康者明显升高，且与慢性期相比，急性进展期的IL-17表达水平要高于其3.5倍，这可在一定程度上说明血清中IL-17水平与多发性硬化病情严重程度具有一定的相关性。也有动物实验发现[6]，EAE小鼠的中枢神经系统中有大量IL-17，该物质所产生的特异性T淋巴细胞可加快EAE的病程，提示IL-17可在EAE发生、发展中起到了重要的作用。在本研究中，分别研究了免疫后10d、16d、30d（三个时间点），即EAE发病前期、急性进展期和慢性期的IL-17表达水平差异，结果显示，在EAE小鼠脊髓组织、大脑组织中，处于EAE发病前期的A组其IL-17阳性细胞数均较处于急性进展期和慢性期的B、C组要明显减少，D组也较E、F组要少（P＜0.05），与上述观点相符，进一步印证了IL-17在EAE病程进展中的作用。
目前在临床上，维生素D已广泛应用于多发性硬化治疗中，获得了大量临床研究的证实。本研究为进一步研究维生素D在EAE中的作用机制，结果发现，补充小剂量维生素的D、E、F组其神经功能评分以及IL-17阳性细胞数均优于缺乏维生素D的A、B、C组（P＜0.05），提示维生素D不仅可以在一定程度上影响IL-17/IL-23轴，抑制IL-17的产生，还可减轻EAE小鼠发病后神经功能损伤。其原因可能是维生素D在体内羟化后形成的1,25二羟基维生素D，具有广泛的抗炎作用，可抑制EAE小鼠中Th17细胞分化，使体内的IL-17表达水平显著减少，有助于减轻神经系统中白质炎性脱髓鞘现象，进而起到神经保护作用。
综上所述，维生素D可通过抑制IL-17轴调节的免疫机制对自身免疫性脑脊髓炎小鼠发挥神经保护作用，减轻炎性细胞浸润和神经纤维髓鞘脱失，延缓病情发展。
【参考文献】
[1]刘博文，谭戈.Th17细胞及相关因子在多发性硬化中表达变化及临床意义[J].重庆医科大学学报，2015，40(1):70-72.
[2]罗高权，刘玲，李鸥，等.血清维生素D水平及添加治疗对多发性硬化患者预后的影响[J].实用医学杂志，2017，33(5):731-735.
[3]孙玉风，尚静，郑震林.CGI-58基因条件敲除对小鼠中枢神经系统功能的影响[J].南通大学学报(医学版)，2016，36(6):513-517.
[4]王艳乔，杨薇.多发性硬化与自身免疫共病[J].中风与神经疾病杂志，2014，31(4):380-381.
[5]王利娟，李晓玲，谢沁芳，等.多发性硬化患者IL-17、IL-27水平的动态表达及意义[J].免疫学杂志，2016，32(7):616-619.
[6]王贵泉，张宇，张美妮.EAE发病机制中MALT1、IL-17作用的探讨[J].中国医学创新，2014，11(15):13-16.
泉州市技术研究与开发项目（No.2015Z33）